基于网络药理学研究黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎的分子机制

周 巧， 刘 健， 郭锦晨， 黄 旦

(1.安徽省中医药科学院中医风湿病防治研究所，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；3.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

骨关节炎的发病因素包括衰老、机械压力、遗传和肥胖[1]。骨关节炎中主要稳态细胞的损害，导致氧化应激反应，细胞功能障碍和衰老[2]。骨关节炎属中医“骨痹”范畴，中医学病机呈现脾虚湿盛、湿热蕴结，痰瘀痹阻，可采用“健脾化湿、清热通络”进行治疗，黄芩清热除痹胶囊为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，具有健脾化湿、清热通络之功。本课题组前期临床研究和细胞实验发现，黄芩清热除痹胶囊可改善骨关节炎患者临床症状，调节促-抑炎体系，发挥抗氧化作用，从而起到治疗骨关节炎的作用[3]。

网络药理学作为一种新的科学方法，分析网络数据和系统生物学是网络药理学的基础，与中医的结合弥补了现代医学与传统医学之间的鸿沟[4]。本研究基于网络药理学，筛选出黄芩清热除痹胶囊活性成分及作用靶点，挖掘黄芩清热除痹胶囊调控骨关节炎的潜在靶点，并通过生物信息学分析，构建药物、靶点、基因、疾病网络图，进行相应富集分析和分子对接，探讨黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎可能的分子机制，为黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎后续实验研究开拓思路，为临床应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 黄芩清热除痹胶囊化学成分筛选及活性成分靶点库构建 通过检索中药系统药理学分析平台即TCMSP数据库，检索黄芩清热除痹胶囊主要中药成分黄芩、栀子、威灵仙、薏苡仁和桃仁，根据 ADME(吸收、分布、代谢、排泄)的参数，口服生物利用度(OB)的筛查阈值设置为≥30%，药物相似度(DL)设置为≥0.18，以筛选有效活性成分。

1.2 Venn分析及药物活性成分-潜在靶点-疾病网络图的构建 将黄芩清热除痹胶囊中药成分输入TCMSP数据库，限定物种是“Homosapiens”，获得中药化合物相关的潜在靶点基因，应用UniProt校正，建立药物活性成分靶点基因数据库。以“Osteoarthritis”为关键词，检索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD数据库，筛选条件为relevance score≥10，收集与骨关节炎相关的已知靶点基因。使用Funrich筛选中药复方靶点和骨关节炎靶点的交集靶点，进行Venn分析。Cytoscape 3.7.2软件构建黄芩清热除痹胶囊活性成分-潜在靶点-疾病网络图。

1.3 蛋白质-蛋白质互作关系(PPI)网络拓扑分析及核心靶点的筛选 将2组交集基因集输入String在线数据库，选择“multiple proteins”分析模式，限定种属为 “Homesapiens”，获取蛋白与蛋白间互作信息，构建PPI作用网络。运用Cytoscape 3.2.1软件，使用CytoNCA插件[5]对核心网络进行筛选。

1.4 核心靶点基因的富集分析 使用R.Data软件，对黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎的核心靶点进行基因本体论(GO)生物过程和KEGG信号通路富集分析，物种选为“Homesapiens”，以P<0.05作为筛选条件，获取相应数据，绘制相应图形。

1.5 活性成分与靶点的分子对接验证 选择主要中药成分化合物与核心靶点进行分子对接。化合物的二维结构图通过PubChem数据库下载，导入到Chem3D软件中以绘制三维结构图，优化后保存为mol2格式，AutoDock Tools1.5.6软件用于制备受体，包括添加氢和设置对接参数，所有配体和受体文件均保存为pdbqt格式，Autodock Vina来评估和验证化合物-靶标关系的结合亲和力，以及网络药理学的预测结果，绑定模型通过PyMol2.3.0软件和Discovery Studio3.5软件可视化。

2 结果

2.1 黄芩清热除痹胶囊有效成分的收集和筛选 最终获得黄芩清热除痹胶囊活性成分90种，其中黄芩36种，栀子15种，桃仁23种，威灵仙7种，薏苡仁9种，有2种成分为2种以上中药所共有。由于黄芩清热除痹胶囊的活性成分较多，仅列出25项，见表1。

2.2 黄芩清热除痹胶囊和疾病骨关节炎潜在作用靶点Venn分析及“中药-活性成分-潜在靶点-疾病”网络展示图的构建 在TCMSP数据库中检索黄芩清热除痹胶囊活性成分对应的靶点，共得到1 767个靶标基因，经过Uniprot将所有靶标进行汇总、去除重复靶标和标准化名称，进行校正后，共得到202个靶标基因。通过检索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD数据库，分别收集到骨关节炎相关靶点基因1 836、33、353、8、28个，去除重复基因后共获得1 944个。对黄芩清热除痹胶囊活性成分对应的202个共同作用靶点与1 944个骨关节炎相关靶点进行Venn分析，获得115个交集基因，即为黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎的潜在作用靶点。Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-活性成分-潜在靶点-疾病”网络展示图，其中，左边圆圈代表复方黄芩清热除痹胶囊中药的活性成分，不同颜色代表不同中药成分，右边网格代表活性成分的靶基因，用蓝色长方形表示，节点越大，代表靶基因相连的成分越多，见图1。

图1 黄芩清热除痹胶囊活性成分-作用靶点相互作用关系网络图

2.3 PPI网络拓扑分析及核心靶点的筛选 将115个交集基因集输入到Cytoscape 3.7.2软件BisoGenet插件，构建PPI网络，见图2。使用CytoNCA插件计算每个网络节点的DC值，筛选出DC>2倍DC中位数(28)的节点。筛选出EC、IC、LAC、BC、CC、NE大于各自中位数的节点，最终筛选出核心靶点11个。分别为丝裂原活化蛋白激酶1,8,14(mitogen-activated protein kinase 1,8,14)、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene)、AP-1转录因子亚基(AP-1 transcription factor subunit)、雌激素受体(estrogen receptor 1，ESR1)、NFKB抑制剂α(NFKB inhibitor alpha，NFKBIA)、RELA原癌基因(RELA proto-oncogene)、NF-KB亚基(NF-KB subunit)、JUN(junctional adhesion molecule 3)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)、肿瘤蛋白P53结合蛋白1(tumor protein P53 binding protein 1，TP53)、MYC原癌基因(MYC proto-oncogene)、BHLH转录因子(BHLH transcription factor)。

表1 黄芩清热除痹胶囊部分活性成分信息

注：左图为初始PPI 网络，中图为筛选出DC>2倍DC中位数(28)的节点，右图为最终筛选出的核心靶点。图2 PPI网络构建及核心靶点的筛选过程图

2.4 核心靶点基因的富集分析 为了解交集基因在骨关节炎治疗中所起的作用，对黄芩清热除痹胶囊的11个核心靶点基因进行GO、KEGG富集分析，设定阈值P<0.05。GO注释条目116个，按照P值升序排列的前20条GO富集结果见图3，生物过程(biological processes，BP)主要参与对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、细胞对生物刺激的反应、外在凋亡信号通路、对抗生素的反应、对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应；细胞组分(cellular component，CC)主要参与膜区、囊泡腔、转录因子复合体细胞质囊泡腔、分泌颗粒腔、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等；分子功能(molecular function，MF)主要参与细胞因子受体结合、血红素结合、氧化还原酶活性、氧化还原酶活性等。按照P值升序排列的前20条KEGG富集通路见图4，黄芩清热除痹胶囊可以作用于IL-17信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等161条信号通路。此外，结果还显示黄芩清热除痹胶囊活性成分的靶基因还涉及其他疾病，如感染疾病、肿瘤、耐药、内分泌与代谢病和神经退行性变等，这提示了黄芩清热除痹胶囊活性成分治疗这些疾病的潜在优势。

图3 GO富集分析(前20条通路)

图4 KEGG富集分析(前20条通路)

2.5 分子对接结果分析 通过筛选的11个核心靶点，以及富集分析得到的骨关节炎相关基因和信号通路，选取有文献报道与骨关节炎相关经典靶点蛋白7个[6-11]，在PDB和Uniprot数据库中检索核心靶点对应的与中药成分相关的小分子配体，以及配体对应的蛋白信息，物种选为“Homesapiens”，见表2。利用Autodock tools软件计算这7个靶点基因与黄芩清热除痹胶囊中药活性成分间的最低结合能，见表3，受体蛋白与活性成分的最低结合能结果小于-5 kcal/mol，表明结合较好，所需的能量越少，结合越稳定。部分分子对接结合模式见图5，黄色圆圈表示小分子化合物与大分子蛋白质之间的对接状态，绿色线条代表氢键。结果显示，活性成分与靶点受体蛋白周围分子通过氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象。

表2 靶点受体蛋白信息

表3 活性成分与靶点受体蛋白间的最低结合能

注：A～D分别为栀子与ESR1、TP53、AKT1、MAPK14对接，E～F分别为黄芩与JUN、FOS对接，G为薏苡仁与MAPK1对接。图5 活性成分与靶点受体蛋白的分子对接模式

3 讨论

骨关节炎的特征是关节软骨细胞的逐渐破坏[12]，本病中医属于“骨痹”范畴，其中医学病机呈现脾虚湿盛、湿热蕴结，痰瘀痹阻[13]，因此采用健脾化湿、清热通络法治疗[14]。黄芩清热除痹胶囊具有健脾化湿、清热通络之功，由黄芩、栀子、威灵仙、薏苡仁、桃仁组成。本研究通过TCMSP 数据库检索出黄芩清热除痹胶囊的主要化学成分有90种，构建黄芩清热除痹胶囊-活性成分-潜在靶点以及骨关节炎疾病相关靶点，通过Venn分析取两者交集基因115个；PPI网络筛选出核心靶点11个，包括MAPK1,8,14、AKT1、ESR1、TP53、JUN、FOS等；构建“中药-活性成分-潜在靶点-疾病”网络发现黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎具有多成分、多靶点的特点；富集结果显示，黄芩清热除痹胶囊参与氧化应激的反应、活性氧的反应、凋亡信号通路、转录因子活性等生物过程；可以作用于IL-17信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、PI3K-Akt信号通路等161条信号通路，由此可见，黄芩清热除痹胶囊可以调控骨关节炎的外在凋亡信号通路、转录因子活性、氧化应激反应。本课题组前期临床研究也发现，黄芩清热除痹胶囊可通过调节促-抑炎体系，调节CD36启动子或者PPARγ表达，进而激活AMPK磷酸化，提高细胞内Mn-SOD表达，使细胞免受氧化损伤，发挥抗氧化、抗炎、抗免疫作用，改善关节炎患者临床症状[15-17]。这与本研究的富集结果相吻合。富集结果还显示，黄芩清热除痹胶囊活性成分的靶基因还涉及其他疾病，如感染疾病、肿瘤、耐药、内分泌与代谢病和神经退行性变等，这提示了黄芩清热除痹胶囊活性成分治疗这些疾病的潜在优势。

对PPI网络拓扑分析中筛选的核心基因进行选择，选取有文献报道与骨关节炎相关经典靶点蛋白7个进行分子对接，分别为ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS，与这些靶点相关的黄芩清热除痹胶囊成分是黄芩、栀子、薏苡仁和威灵仙，且AutoDock Tools计算出的最低结合能结果均小于-5 kcal/mol，表示结合稳定。故黄芩清热除痹胶囊可以通过ESR1、TP53、AKT1、JUN、MAPK1、MAPK14、FOS等靶点治疗骨关节炎。雌激素受体1(estrogen receptor,ESR) 是一种小分子类固醇激素，该基因多态性与膝骨关节炎发病有一定联系，ESR1基因突变可能会增加膝骨关节炎患病风险。TP53基因编码的p53蛋白的作用是调控细胞分裂和增殖。JUN和FOS是编码激活蛋白-1(AP-1)的不同亚单位，含有FOS的AP-1杂二聚体被证明是软骨细胞分化所必需的。另外，JUN表达的c-Jun蛋白对调节软骨细胞的凋亡有重要作用[10]。MAPK蛋白等通过调控自噬相关信号通路,一方面抑制间充质干细胞向软骨细胞转化，减少软骨细胞产生；一方面改变细胞生长环境促进软骨细胞的凋亡，增加软骨细胞的损失，而软骨细胞数量的减少又伴随着软骨细胞外基质生成不足，从而促进软骨退变[11]。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接技术，展示了黄芩清热除痹胶囊治疗骨关节炎的复杂分子网络关系，体现了中药复方多成分、多靶点、多通路的治病特点。研究还发现黄芩清热除痹胶囊参与骨关节炎活性氧的反应、凋亡信号通路、转录因子活性等生物过程，也可以作用于IL-17信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等，发挥调节免疫炎症反应、调控细胞凋亡及调节氧化应激反应等作用来治疗骨关节炎。