山茱萸多糖对D-半乳糖致衰老大鼠学习记忆能力及Klotho/Akt信号通路的影响

欧 芹， 张鹏霞， 范慧晗， 刘泰佐

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

社会人口老龄化的进程促使对延缓衰老、提高老年人群生存质量的研究不断进行。对衰老相关基因研究发现，Klotho基因突变导致多个早衰样表型出现，包括短寿命、动脉硬化等；而过表达可对小鼠寿命有明显的延长[1-2]。尽管Klotho的遗传突变导致多种衰老相关疾病[3-5]，但相关的研究都明确地显示Klotho基因只在小鼠、大鼠和人类的有限组织中表达。Klotho的表达可受许多因素的调节，表达后在维持细胞代谢平衡等方面发挥作用。山茱萸多糖(cornel polysaccharid，COP)可显著提高小鼠抗氧化能力、免疫力、增强细胞活力、影响细胞周期调控因子作用；还可改善衰老脑组织老化程度以及抗休克的作用[5-6]。本课题组前期研究发现，含山茱萸多糖血清可调节细胞周期运行，发挥抗人二倍体成纤维细胞衰老作用；水煎剂和山茱萸多糖均可通过抗氧化、提高衰老大鼠学习记忆能力[7]。本实验主要探究山茱萸多糖提高脑老化模型大鼠学习记忆能力是否与调节Klotho及其下游底物Akt、FoxO3a、Mn-SOD的表达有关，为脑老化的干预提供一个新的靶点和新的药物。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar大鼠60只，清洁级，雌雄各半，体质量220～240 g，购自佳木斯大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(黑)2013004。所有大鼠适应性喂养1周后进行实验。

1.2 试剂与药物 山茱萸多糖(宁波德康生物制品有限公司，批号20120110)，硫酸-苯酚法测定多糖含量为75.8%。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Klotho抗体、Mn-SOD抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；β-半乳糖苷酶活性试剂盒(上海润裕生物科技有限公司)；D-半乳糖(上海澄绍生物科技公司)；Trizol、DEPC、RT-PCR试剂盒、DNA maker[宝生物工程 (大连) 有限公司]。

1.3 造模及分组 大鼠随机分为2组，正常组10只，脑老化造模组50只，造模大鼠腹腔注射60 mg/kg 5%D-半乳糖氯化钠溶液，连续6周，进行Y迷宫筛查，检测15次，较正常组正确次数下降15%～30%的大鼠为造模成功。将造模成功的48只脑老化模型大鼠随机分为4组，即模型组及山茱萸多糖低、中、高剂量组。

1.4 给药 从第7周起，山茱萸多糖低、中、高剂量组分别灌胃给予山茱萸多糖水溶液50、100、200 mg/kg，正常组和模型组灌胃给予等容量蒸馏水，连续6周。

1.5 样本采集 最后1次给药后，次日用Morris水迷宫检测大鼠定位航行和空间探索能力，结束后，乙醚麻醉后断头处死，取脑组织并分离海马，用于检测Klotho、Mn-SOD、Akt、FoxO3a表达；剩余脑组织制备成10%匀浆液，用于检测β-半乳糖苷酶活性。

1.6 Morris水迷宫法检测大鼠学习记忆能力 参考文献[8]报道，第1～5天，Morris水迷宫水下1 cm放置圆形平台，从远离平台象限处放下大鼠，记录大鼠到达平台时间，为逃避潜伏期。如果大鼠2 min没有到达平台，需放置于平台30 s，系统自动跟踪记录大鼠活动轨迹，每天进行1次。第6天，进行空间探索实验，撤除平台，记录120 s大鼠穿过原平台的次数、原平台象限游泳的时间和距离，反映记忆能力。

1.7 RT-PCR法检测Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SODmRNA表达 根据试剂盒说明书进行操作，使用凝胶图像成像系统(Tanon-2500R)分析mRNA表达，GAPDH作为内参，以目的基因与内参基因比值表示目的基因相对表达量。

1.8 免疫组化法检测Klotho、Mn-SOD蛋白表达 海马组织切片脱蜡至水，双氧水处理阻断内源性过氧化物酶后，微波热修复，山羊血清封闭，加入一抗、二抗，DAB显色，棕黄色为阳性表达。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析阳性染色区域光密度值。

1.9 邻硝基苯法检测β-半乳糖苷酶活性 根据试剂盒说明书检测β-半乳糖苷酶活性，总蛋白质检测采用考马斯亮蓝法。

2 结果

2.1 山茱萸多糖对脑老化大鼠学习记忆能力的影响 与正常组比较，模型组和山茱萸多糖各剂量组大鼠学习第1天，逃避潜伏期延长(P<0.01)，随着学习天数增加，大鼠逃避潜伏期缩短，但与正常组比较仍有显著差异(P<0.05)；山茱萸多糖中、高剂量组大鼠逃避潜伏时间短于模型组(P<0.01)和低剂量组(P<0.05)，见图1。给药结束后，检测各组大鼠的空间探索能力，以跨越平台区次数、有效象限游泳时间比和有效象限游泳路程比代表空间探索能力，结果见表1，模型组大鼠空间探索能力低于正常组(P<0.01)；而各剂量山茱萸多糖均能提高脑老化大鼠空间探索能力(P<0.05，P<0.01)，中、高剂量效果优于低剂量(P<0.05)。

表1 山茱萸多糖对脑老化大鼠空间探索能力的影响

2.2 山茱萸多糖对脑老化大鼠脑组织β-半乳糖苷酶活性的影响 与正常组比较，模型组大鼠脑组织β-半乳糖苷酶活性升高(P<0.01)；与模型组比较，山茱萸多糖各剂量组大鼠脑组织β-半乳糖苷酶活性均降低(P<0.05,P<0.01)，且中、高剂量效果优于低剂量组(P<0.01)，见表2。

表2 山茱萸多糖对脑老化大鼠β-半乳糖苷酶活性的影响

2.3 山茱萸多糖对脑老化大鼠海马Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SODmRNA表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠海马Klotho、FoxO3a、Mn-SODmRNA表达降低(P<0.01)，AktmRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，山茱萸多糖各剂量组大鼠海马Klotho、FoxO3a、Mn-SODmRNA表达均升高(P<0.01)，山茱萸多糖中、高剂量组大鼠海马AktmRNA表达降低(P<0.01)，且中、高剂量效果优于低剂量(P<0.05，P<0.01)，见图2、表3。

2.4 山茱萸多糖对脑老化大鼠海马组织中Klotho、Mn-SOD蛋白表达的影响 如图3、表4所示，与正常组比较，模型组大鼠海马组织Klotho、Mn-SOD蛋白表达降低(P<0.01)；与模型组比较，山茱萸多糖各剂量组大鼠海马组织Klotho、Mn-SOD蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)。

3 讨论

脑功能的退行性改变是衰老的最重要变化之一，由于海马与学习记忆功能密切相关, 可作为衰老时脑功能退行性改变研究的较理想靶区。本研究中发现，脑老化模型大鼠海马神经细胞排列紊乱、细胞密度减少，细胞出现空泡等，模型大鼠出现学习记忆能力下降和衰老相关的β-半乳糖苷酶活性增强，模拟了脑老化的典型变化。Klotho在调控衰老及年龄相关性疾病的发展中有非常关键的作用，最近的研究已经确定FoxO3a在脑、心脏、肾脏和脾脏中的水平尤为丰富，在调节机体衰老中发挥作用[9-10]。本研究结果表明，山茱萸多糖通过上调Klotho下游分子Mn-SOD的表达，改善脑细胞的功能。这种作用可能是脑衰老时，海马组织中Klotho的表达减少，降低了其对Akt表达、FoxO3a磷酸化的抑制作用，而使衰老大鼠胞质中的FoxO3a增多，影响了FoxO3a从细胞质向胞核的转位，从而使Mn-SOD表达降低，最终使过氧化产物增多并累积，导致脑功能紊乱和减退。虽然Klotho抑制衰老的具体机制目前尚不明确，但从INS/IGF-1通路的一系列关键下游靶点Akt、FoxO3a和Mn-SOD的表达结果来分析，衰老大鼠的学习记忆能力的减退与INS/IGF-1下游的Klotho、Akt、Fox3a和Mn-SOD的调节有关[11-12]。

图2 各组大鼠海马Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SOD mRNA的表达

表3 山茱萸多糖对脑老化大鼠海马Klotho、Akt、FoxO3a、Mn-SOD mRNA表达的影响

表4 山茱萸多糖对脑老化大鼠海马组织中Klotho、Mn-SOD蛋白表达的影响

本实验研究结果表明，山茱萸多糖能够改善衰老大鼠的学习记忆能力，而且这种改善与其对Klotho及其下游信号分子的调节有关。山茱萸多糖可通过上调Klotho的表达，增加其对Akt的抑制作用，减少FoxO3a的磷酸化，促使FoxO3a进入细胞核结合在SOD顺式调节元件上，进而促进Mn-SOD的表达，提高超氧阴离子自由基的清除，使自由基及其连锁反应产物造成的组织损伤降低，而改善脑老化造成的细胞功能障碍。但是，Klotho的作用只是衰老时学习记忆的减退机制的其中之一，山茱萸多糖改善学习记忆能力的其他途径和机制还有待于不断的完善和进一步的研究。