蛇黄凝胶处方工艺的优化

田 斌， 瞿孝兰， 林义平， 宋 英， 袁强华*

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072)

湿疹是一种以剧烈瘙痒与皮肤炎症为主要症状，伴有干燥、脱落、渗液、出血等的过敏性炎性反应性皮肤病[1]，临床上常根据其皮损表现分为急性湿疹、亚急性湿疹、慢性湿疹。中医认为，湿疹发病原因与先天禀赋不足后外感风、湿、热等邪气，内热外热相结合发于肌肤相关[2-3]；西医认为，它主要与遗传因素、环境因素、药物因素、免疫因素、肠道与皮肤微生物群落失调、肠黏膜屏障功能异常有关[4-7]。

目前，治疗湿疹以消除皮肤炎症和感染,保护和恢复皮肤屏障功能，控制恶化因素为主要目标[8]，常用药物包括类固醇、皮质类激素、抗组胺药物、抗生素、糖皮质激素、局部钙调神经磷酸酶抑制剂等[9]，但长期使用后会引起皮肤干燥、脆性增加，色素沉着与多毛，皮肤皱缩、皱襞等不良反应[10]。中药外治湿疹大多用清热燥湿解毒、杀虫止痒药[11]，从而达到止痒、抗炎、杀菌的目的，其中蛇黄软膏由黄柏、蛇床子组成，用于治疗亚急性湿疹，但其采用原粉入药，存在载药量较小、单次用量大、有效成分逸出缓慢等弊端。凝胶剂作为近年来外用制剂的研究热点，具有稳定性较好、附着性强、释药稳定、涂布均匀、易清洗、不污染衣物等优点[12]，故本实验开发新制剂蛇黄凝胶以解决上述问题。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；BP-211D型电子天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；LE204E型电子天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；KH-250B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；PHS-3C型酸度计(上海精密仪器科学有限公司)；DF-101Z型集热式恒温加热磁力搅拌器(上海秋佐科学仪器有限公司)；TG-20型台式高速离心机(四川蜀科仪器有限公司)；DHG-9023A小型台式干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试剂与药物 盐酸黄柏碱(批号111895-201504，纯度94.9%)、盐酸小檗碱(批号110713-201613，纯度86.8%)、蛇床子素(批号110822-201710，纯度99.5%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；欧前胡素对照品(批号191120，纯度98%)购自成都植标化纯生物技术有限公司。壳聚糖(批号20032504)、羟丙甲纤维素(批号19041504)均购自湖南新绿方药业有限公司；羧甲纤维素钠(批号TF78200401)购自湖南九典宏阳制药有限公司；卡波姆940(批号20200522)购自博新化工原料有限公司；甘油(批号000120180804)购自湖南尔康制药股份有限公司，生理盐水(批号18081611)购自四川美大康佳乐药业有限公司；透析袋(截留分子量3 500)。磷酸、乙腈均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 黄柏-蛇床子提取物制备 采用课题组前期筛选出的最优提取工艺，即取黄柏600 g、蛇床子300 g，粉碎至粗粉，混匀，加24倍80%乙醇浸渍8 h后以2 mL/min体积流量进行渗漉提取，收集提取液，回收乙醇，水浴蒸发至稠膏状，进行减压干燥，即得。

2.2 色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-[乙腈-0.1%磷酸(每100 mL含0.2 g SDS)](B)(15∶85)，梯度洗脱(0～18 min，27%～29%A；18～23 min，29%～37%A；23～40 min，37%～38%A；40～60 min，38%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长220 nm(欧前胡素)、230 nm(盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱)、322 nm(蛇床子素)；进样量5 μL。

2.3 凝胶剂基质选择 表1显示，卡波姆效果最理想，但由于黄柏提取物主要成分为生物碱，与其混合后黏度急剧降低，产生不可溶性沉淀，导致药物难于分散均匀，不宜作为基质；CMC-Na、HPMC也均可形成均匀细腻的凝胶，但其在黏性、流变性方面未达到凝胶基质要求，故将两者混用以改善上述问题。

表1 不同基质考察结果

2.4 单因素试验

2.4.1 HPMC用量 每10 g凝胶中固定黄柏-蛇床子提取物用量0.5 g，pH 7，甘油用量1 g，CMC-Na用量0.1 g，设定HPMC用量为2%、3%、4%、5%、6%，结果见表2。由此可知，当HPMC用量大于5%时，凝胶整体黏稠度较大，较难涂布，也难以将药物均匀覆盖至皮肤表面；当用量小于3%时，凝胶成型性较差，黏稠度较低，导致药物在皮肤附着性较差；当用量在3%～5%范围内时，凝胶外观光滑均匀细腻，黏稠度适中，成型性好，易于涂布，故选择3%～5%作下一步考察。

表2 HPMC用量筛选结果

2.4.2 甘油用量 每10 g凝胶中固定黄柏-蛇床子提取物用量0.5 g，pH 7，HPMC 0.4 g，CMC-Na 0.1 g，设定甘油用量为0、5%、10%、15%、20%，结果见表3。由此可知，当不加入甘油时，凝胶黏度较低，皮肤附着性较差；当用量达到20%时，凝胶黏稠度较大，不易涂展；用量在5%～15%范围内时，黏度适中，涂展性较好，故选择5%～15%作下一步考察。

表3 甘油用量筛选结果

2.4.3 载药量 每10 g凝胶中固定HPMC 用量0.4 g，CMC-Na用量 0.1 g，pH 7，甘油用量1 g，设定载药量为3%、5%、7%、9%、11%，结果见表4。由此可知，当载药量在3%～7%范围内时，凝胶成型性较好，黏稠度适中，容易涂展；当载药量达到9%后，凝胶质地不均，出现结块现象，成型性较差，黏稠度较大，不易涂展；当载药量达到11%时，凝胶稠度过大，难以混合均匀，药物结块不能分散，故选择3%～7%作下一步考察。

表4 载药量筛选结果

2.5 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，选择HPMC用量(A)、甘油用量(B)、载药量(C)作为影响因素，综合评分作为评价指标，计算公式为综合评分Y=(制剂得分/最大值)×0.5+(体外释放度/最大值)×0.5，其中制剂得分=外观性状×0.4+黏稠度×0.3+涂展性×0.3，满分为100分，采用Box-Behnken响应面法优化处方，评分标准见表5，因素水平见表6，结果见表7，Box-Behnken设计响应曲面拟合结果见表8。

表5 制剂评分标准

表6 因素水平

响应面分析见图1。由此可知，HPMC用量与甘油用量、HPMC用量与载药量、甘油用量与载药量的3D曲线均较陡，等高线均趋于椭圆，表明三者之间交互作用显著，与表8一致。通过Design-Expert 8.0.6软件，最终得到最优处方为HPMC用量3.93%，CMC-Na用量1%，甘油用量10.17%，载药量4.74%，pH 7，考虑到实际操作的便捷性，将其修正为HPMC用量4%，CMC-Na用量1%，甘油用量10%，载药量5%，pH 7。

表7 试验设计与结果

表8 方差分析

图1 各因素响应面图

2.6 验证试验 按上述优化工艺制备5批凝胶，进行验证试验，结果见表9，可知该工艺稳定可行。

2.7 体外释放度测定

2.7.1 线性关系考察 精密称取盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱、欧前胡素、蛇床子素对照品2.82、28.65、2.42、4.07 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，精密吸取1、3、5、7、9 mL至20 mL量瓶中，甲醇定容至刻度。以质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行回归，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见表10，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.7.2 提取物含量测定 精密称取“2.1”项下提取物0.1 g，置于100 mL锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定质量，超声提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算含量。结果，每1 g提取物含盐酸黄柏碱18.094 6 mg、盐酸小檗碱154.244 9 mg、欧前胡素9.951 8 mg、蛇床子素26.194 1 mg。

表9 验证试验结果(n=5)

表10 各成分线性关系

2.7.3 测定方法 参照2015年版《中国药典》四部第三法[13]，精密称取蛇黄凝胶1 g，置于透析袋(截留相对分子质量3 500)中，以含20%乙醇的生理盐水200 mL为接收液，将透析袋置于扩散池中，在温度(37±0.5) ℃、转速100 r/min条件下于1、2、4、6、8、10、12 h取接收液各5 mL，同时补充等温度、等体积的接收液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算各成分在不同时间点的累积释放度。

2.8 稳定性考察

2.8.1 耐高温试验 取5批蛇黄凝胶，在60 ℃下恒温加热12 h后取出，静置至室温，发现该制剂外观性状无明显变化，质地均匀细腻，黏稠度适中无变稀现象，易于涂布，表明其耐热性良好。

2.8.2 耐寒试验 取5批蛇黄凝胶适量，在-20 ℃下冷藏24 h后取出，静置至室温，发现该制剂外观性状无明显变化，也无分层、变稀现象，易于涂布，表明其耐寒性良好。

2.8.3 离心试验 取5批蛇黄凝胶，置于离心管中，4 500 r/min离心20 min，发现该制剂外观性状均匀，无分层、变稀现象，涂展性良好，表明其离心稳定性良好。

3 讨论

在药物处方筛选优化过程中，所用方法主要包括正交设计、均匀设计、Box-Behnken响应面法等，其中正交设计、均匀设计存在试验精密度较低、模型预测性较差等问题；Box-Behnken响应面法基于非线性模式进行研究，可确定在试验范围内任何试验点的预测值，具有试验次数少、精密度和结果可信度高、预测性好等优点[14-16]。本实验以制剂外观性状、体外释放度为评价指标，通过Box-Behnken响应面法优化蛇黄凝胶剂处方工艺，并进行验证试验，发现该工艺合理可行，稳定易控。

生物碱类成分易与卡波姆发生反应，从而导致凝胶黏度降低，产生不溶性沉淀。pH虽对基质黏度有较大影响，但本实验控制pH在卡波姆较为适宜成型的范围内依然无法成型，其原因可能是黄柏中主要提取出的生物碱为盐酸小檗碱，属季胺碱、强电解质，而离子浓度可影响整个凝胶系统的流变学行为，导致黏度降低。

课题组前期在药材成分含量测定中发现，酸性条件会导致蛇床子中有效成分欧前胡素发生结构转化，生成花椒毒素，后者虽具有一定抗炎抗菌作用，但其结构中的酚羟基在空气中易氧化为无效物质[17]。综合考虑制剂成型性、对药效成分保护作用、使用时对皮肤保护作用，最终拟定pH为7。

目前，市面上常用的中药凝胶剂较少，这与中药处方药味众多、成分复杂、辅料选择有限有一定关系。在后续中药凝胶剂的开发过程中，一方面应重点关注药效物质指认、提取、分离纯化；另一方面，应致力于新辅料研发，平衡药物与辅料、生物体之间的相容性，从而为相关研究提供新思路。