女贞子多糖对IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤和炎症反应的作用

张安琪， 郑福增， 周子朋， 赵晶晶， 袁都户

(1.河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450000；2.河南省中医院风湿科，河南 郑州 450000)

骨关节炎是全球最普遍的老年常发的慢性关节疾病，发病率逐年上升，软骨细胞凋亡及炎症反应与其发病机制密切相关[1-2]。中药治疗骨关节炎具有独特优势，可抑制炎症相关因子的分泌，改善软骨基质合成及分解代谢失衡，抑制软骨细胞凋亡等[3-4]。女贞子含有多糖、黄酮类、三萜类等成分，其中多糖含量最高，具有免疫调节和抗氧化的作用[5-6]，其提取物可通过抑制软骨细胞肥大干预大鼠膝骨关节炎疼痛[7]；多糖对脂多糖诱导的大鼠睾丸支持细胞炎性损伤具有保护作用[8]，但该成分对关节软骨细胞的凋亡和炎症反应的影响及机制尚不明确。

研究表明，非编码RNA(包括lncRNA、miRNA和circRNA)在软骨细胞凋亡及骨关节炎的发生发展中起潜在作用[9]，在原发性膝关节骨关节炎的软骨组织及细胞中，miR-145呈低表达[10]，它可通过靶向抑制Bcl2相互作用蛋白3(BNIP3)和调节Notch信号通路来减少骨关节炎中软骨细胞的凋亡[11]。课题组前期发现，miR-145与circ_0039411有结合位点，并且沉默circ_0039411可以阻止氧化钕引起的支气管上皮细胞炎症，炎症反应的发生[12]，但其对关节软骨细胞凋亡和炎症反应的影响尚不明确。本实验旨在研究女贞子多糖对关节软骨细胞的凋亡和炎症反应的影响，并考察其机制是否与circ_0039411和miR-145有关，以期为骨关节炎发病机理及防治研究提供新的理论基础。

1 材料

1.1 细胞 人关节软骨细胞，购自上海博湖生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 女贞子多糖(批号20200104)购自四川省维克奇生物科技有限公司。DMEM培养液(批号20190204)购自美国HyClone公司；白细胞介素-1β(interleukin，IL-1β)(批号20200603)购自上海沪震生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)试剂盒(批号20200509)购自上海彩佑实业有限公司；凋亡检测试剂盒(批号20200607)购自北京沃凯生物科技有限公司；总蛋白提取试剂盒(批号20200308)购自武汉纯度生物科技有限公司；IL-8、IL-6、IL-10酶联免疫吸附试剂盒(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(批号20201002、20200906、20200922)购自上海美轩生物科技有限公司；荧光定量试剂盒(批号20200507)购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号20201019)购自上海泽叶生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分组 人关节软骨细胞用DMEM培养液培养，将其分为对照组、模型组及女贞子多糖低、中、高剂量组，对照组不作任何处理，模型组用50 ng/mL IL-1β处理，女贞子多糖低、中、高剂量组分别用50、200、800 μg/mL女贞子多糖和50 ng/mL IL-1β处理。将circ_0039411干扰表达质粒及阴性对照，miR-145模拟物及阴性对照转染至软骨细胞，再用50 ng/mL IL-1β处理，作为si-circ_0039411组、si-NC组、miR-145组、miR-NC组；将circ_0039411过表达载体质粒及miR-145抑制表达质粒染至软骨细胞，再用800 μg/mL女贞子多糖和50 ng/mL IL-1β处理，作为女贞子多糖+pcDNA-circ_0039411组、女贞子多糖+anti-miR-145组。

2.2 MTT法检测软骨细胞增殖活性 细胞按“2.1”项下方法分组培养48 h，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，采用酶标仪检测490 nm波长处光密度(OD)来表示细胞相对活力。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞按“2.1”项下方法分组培养48 h，离心收集，PBS漂洗后制成单细胞悬液，加入500 μL缓冲液，混匀后加入Annexin V-FITC、PI各10 μL，混匀后避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

2.4 Western blot法检测细胞蛋白表达 细胞按“2.1”项下方法分组培养48 h，离心收集，提取总蛋白，煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，90 V 30 min后改成120 V 2 h，湿转法移至PVDF膜上，加入5%脱脂牛奶室温封闭2 h，将膜放入含有一抗的杂交袋中，在37 ℃下孵育2 h，将PVDF膜放入含二抗的杂交袋中，室温孵育2 h，ECL发光显影，定影成像后检测蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达。

2.5 ELISA法检测细胞上清液IL-8、IL-6、IL-10水平 细胞按“2.1”项下方法分组培养48 h，离心收集细胞上清液，按照试剂盒说明操作，检测细胞上清液IL-8、IL-6、IL-10水平。

2.6 RT-qPCR法检测细胞circ_0039411、miR-145表达 细胞按“2.1”项下方法分组培养48 h，离心收集，提取总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行RT-qPCR反应，反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达。引物序列为circ_0039411正向5′-GGCACTTTTCACGTGTCACC-3′，反向5′-GTGAA GGGGAAGACACAGGG-3′；miR-145正向5′-GGATTCCTGGAAATACUGTTCT-3′，反向5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTC-3′；内参GAPDH正向5′-CCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向5′-CGTTCAG CTCAGGGATGAC-3′；内参U6正向5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′。

2.7 双荧光素酶报告实验 构建circ_0039411野生型和突变型荧光素酶载体WT-circ_0039411、MUT-circ_0039411，将其分别与miR-NC、miR-145共转染至软骨细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性。

3 结果

3.1 女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响 由图1、表1可知，与对照组比较，模型组软骨细胞活性降低，细胞凋亡率升高，Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，女贞子多糖各剂量组软骨细胞活性升高，细胞凋亡率降低，Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，呈剂量依赖性(P<0.05)。

注：1～5分别为对照组，模型组，女贞子多糖低、中、高剂量组。A为各组细胞凋亡情况，B为各组细胞凋亡相关蛋白表达。图1 女贞子多糖对软骨细胞凋亡的影响Fig.1 Effects of L. lucidum polysaccharide on chondrocyte apoptosis

表1 女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响

3.2 女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞炎症因子的影响 由表2可知，与对照组比较，模型组软骨细胞中IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；与模型组比较，女贞子多糖各剂量组软骨细胞中IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高，呈剂量依赖性(P<0.05)。

表2 女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞炎症因子的影响

3.3 女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞中circ_0039411、miR-145表达的影响 由图2可知，与对照组比较，模型组软骨细胞中circ_0039411表达升高，miR-145表达降低(P<0.05)；与模型组比较，女贞子多糖各剂量组软骨细胞中circ_0039411表达降低，miR-145表达升高，并呈剂量依赖性(P<0.05)。

注：1～5分别为对照组，模型组，女贞子多糖低、中、高剂量组。与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与女贞子多糖低剂量组比较，&P<0.05；与女贞子多糖中剂量组比较，$P<0.05。图2 各组细胞中circ_0039411、miR-145的表达Fig.2 Expressions of cellular circ_0039411 and miR-145 in each

3.4 干扰circ_0039411对IL-1β诱导的软骨细胞损伤及炎症因子的影响 由图3、表3可知，与模型组比较，si-NC组软骨细胞circ_0039411、miR-145表达，细胞活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表达，IL-8、IL-6、IL-10水平均无明显变化(P>0.05)；与si-NC组比较，si-circ_0039411组软骨细胞circ_0039411表达降低，miR-145表达升高，细胞活性升高，凋亡率降低，Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。

注：1～3分别为模型组、si-NC组、si-circ_0039411组。A为各组细胞凋亡情况，B为各组细胞凋亡相关蛋白表达，C～D为circ_0039411、miR-145表达。与模型组比较，*P<0.05；与si-NC组比较，#P<0.05。图3 干扰circ_0039411对软骨细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of interference with circ_0039411 on chondrocyte apoptosis

3.5 miR-145对IL-1β诱导的软骨细胞损伤及炎症因子的影响 由图4、表4可知，与模型组比较，miR-NC组软骨细胞miR-145表达，细胞活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表达，IL-8、IL-6、IL-10水平均无明显变化(P>0.05)；与miR-NC组比较，miR-145组软骨细胞miR-145表达升高，细胞活性升高，细胞凋亡率降低，Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。

表3 干扰circ_0039411对IL-1β诱导的软骨细胞损伤及炎症因子的影响

注：1～3分别为模型组、miR-NC组、miR-145组。A为各组细胞凋亡情况，B为各组细胞凋亡相关蛋白表达，C为各组细胞miR-145表达。与模型组比较，*P<0.05;与miR-NC组比较，#P<0.05。图4 miR-145对软骨细胞凋亡的影响Fig.4 Effects of miR-145 on chondrocyte apoptosis

3.6 circ_0039411和miR-145靶向关系 由图5可知，circ_0039411和miR-145互补序列。由表5可知，WT-circ_0039411与miR-145共转染后的细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，而MUT-circ_0039411与miR-145共转染后的细胞荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。

3.7 过表达circ_0039411或抑制miR-145可逆转女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞损伤炎症因子的影响 由图6、表6可知，与女贞子多糖组比较，女贞子多糖+pcDNA-circ_0039411组和女贞子多糖+anti-miR-145组软骨细胞的活性降低，细胞凋亡率升高，Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。

表4 miR-145对IL-1β诱导的软骨细胞损伤及炎症因子的影响

图5 circ_0039411和miR-145互补序列Fig.5 Complementary sequence of circ_0039411and miR-145

表5 双荧光素酶报告基因

4 讨论

骨关节炎是退行性关节疾病，以关节软骨破坏为特征，其中软骨细胞凋亡起着关键作用；而炎症可引起软骨细胞凋亡，导致软骨破坏[13-14]。研究发现中药可缓解关节炎患者病症，治疗骨关节炎[15]。研究报道鹰嘴豆素通过抑制含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family, pyrin domain-containing 3，NLRP3)介导的细胞凋亡可减轻骨关节炎[16]；青蒿琥酯可减轻IL-1β诱导的炎症反应和细胞凋亡，并延缓小鼠模型中骨关节炎的进展[17]；女贞叶的甲醇提取物在啮齿类动物中具有止痛和消炎作用[18]；女贞细枝中分离出的新的类蛇药苷具有抗炎和神经保护作用[19]，而女贞子多糖对关节软骨细胞凋亡和炎症反应的影响尚不清楚。本实验用IL-1β诱导软骨细胞模拟体外骨关节炎，用不同剂量女贞子多糖进行处理，结果显示，软骨细胞活性升高，细胞凋亡率降低，Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低，呈剂量依赖性。IL-8、IL-6是促炎因子，IL-10是抑炎因子，表明女贞子多糖可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和炎症反应。

注：1～4分别为模型组、女贞子多糖组、女贞子多糖+pcDNA-circ_0039411组、女贞子多糖+anti-miR-145组。A为各组细胞凋亡情况，B为各组细胞凋亡相关蛋白表达，C～D为各组细胞circ_0039411、miR-145表达。与模型组比较，*P<0.05；与女贞子多糖组比较，#P<0.05。图6 过表达circ_0039411或抑制miR-145对软骨细胞凋亡的影响Fig.6 Effects of circ_0039411 overexpression or miR-145 inhibition on chondrocyte apoptosis

表6 过表达circ_0039411或抑制miR-145对软骨细胞损伤炎症因子的影响

研究报道miR-145通过直接抑制丝裂原活化的蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)来减轻骨关节炎中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)驱动的软骨基质降解[20]。来自脂肪干细胞的外泌体通过上调miR-145促进软骨生成并抑制炎症[21]。LncRNA MALAT1通过调控miR-145调节人骨关节炎中IL-1β诱导的软骨细胞活力和软骨基质降解[22]。本实验结果显示，过表达miR-145后软骨细胞的活性升高，细胞凋亡率降低，Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高，表明过表达miR-145可抑制IL-1β诱导的软细胞凋亡和炎症反应。此外，本实验证明circ_0039411靶向调控miR-145，干扰circ_0039411表达的作用与过表达miR-145的作用相同。本实验还发现女贞子多糖可提高circ_0039411的表达，降低miR-145的表达，而过表达circ_0039411或抑制miR-145可逆转女贞子多糖对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响。

综上所述，女贞子多糖可能通过调节circ_0039411/miR-145缓解IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤和炎症反应。