痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平与患儿哮喘严重程度及气道重塑的相关性分析

何国庆，李斌

儿童哮喘已被证实为一种慢性气道炎症性疾病［1］。该病可导致患儿气道反应性增加，临床主要表现为长时间反复出现的咳嗽、喘息、气促以及胸闷等症状，且在夜间或清晨症状有加剧现象［2］。近几年儿童哮喘发病率持续上升。据相关数据显示，2000 年以前我国儿童哮喘患病率约为0.91%，2000年以后已上升为1.60%，该病已严重影响患儿成长阶段的身心健康［3］。患儿哮喘最重要的3 个病理改变为气道炎症、气道重塑和平滑肌功能紊乱，其中气道炎症是患儿哮喘最基本的病理改变，也是气道高反应和病情反复发生的重要因素之一［4］。这种气道内炎症会导致机体分泌大量的白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-25（IL-25）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎症因子，直接损伤肺组织。这些炎症因子可作为患儿哮喘的检测指标［5］。人中性粒细胞防御素（HNP1-3）主要分布于人多形核中性粒细胞（PMN）中。相关研究发现，患儿哮喘时多种细胞都能够表达HNP1-3；人软骨糖蛋白-39（YKL-40）作为由多种细胞分泌的一种与炎症相关的糖蛋白，多数学者认为其在免疫炎症反应、刺激血管生成以及抗细胞凋亡等方面起到重要作用［6］。然而临床上关于IL-25、HNP-13、YKL-40 表达水平与患儿哮喘严重程度的研究并不多见。本研究对比分析哮喘患儿痰中IL-25、HNP-13、YKL-40 表达水平与哮喘严重程度的关系以及与气道重塑的相关性。报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019 年1 月至2020 年6 月在海安市人民医院就诊的214 例急性哮喘患儿作为研究对象，根据《2014 年全球哮喘防治创议委员会儿童支气管哮喘最新修订指南》［7］，将所有患儿分为轻度组、中度组、重度组3 组。其中，轻度组58例，男37 例，女21 例，平均6～13 岁［（8.46±4.44）岁］；中度组91 例，男58 例，女33 例，年龄7～14 岁［（9.39 ± 5.62）岁］；重度组65 例，男38 例，女27例，年龄7～12 岁［（8.17 ± 4.12）岁］。同期选择50例健康幼儿作为对照组，其中，男28 例，女22 例，年龄6～14 岁［（9.76±4.57）岁］。

1.2 纳入及排除标准 患儿纳入标准：（1）符合儿童支气管哮喘诊断标准；（2）近1 个月无糖皮质激素治疗史；（3）无其他过敏性疾病；（4）年龄≤14 岁；（5）患儿及其家长签署本研究知情协议书。排除标准：（1）入院前2 周出现急性呼吸道感染；（2）合并支气管扩张、肺间质性疾病等肺部其他疾病；（3）合并肝硬化、糖尿病以及严重脏器疾病；（4）无法配合研究者。对照组健康幼儿纳入标准：（1）监护人均知情同意；（2）身体健康。排除标准：（1）有支气管疾病家族史；（2）研究期间退出试验者。各组幼儿一般资料经检验差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会审定批准。

1.3 治疗方法 全部患儿入院后均进行规范治疗，给予孟鲁司特钠等常规治疗，治疗期间根据患儿具体病情给予β2受体激动剂治疗，合并感染患儿给予对应抗生素治疗，1 周/疗程，共4 个疗程。

1.4 观察指标 （1）肺功能指标检测。采用德国耶格MasterScreen PFT System 型肺功能仪（德国耶格公司）检测并比较患儿及受试者肺功能第1秒用力呼气量（FEV1）、用力肺活量（FVC）及最大呼气峰流速（PEF）。（2）痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 表达水平检测。按照肖伟等［8］提供的诱导痰步骤，总诱导痰时间不超过30 min，于1 h 内将痰液称重并加入5 倍0.1% 的二硫苏糖醇，然后根据使用习惯反复吹打并置于摇床摇荡5 min，随后置于37℃恒温箱培育15 min，培育完成后用无菌纱布过滤掉多余的黏液并置于离心管内，以3 000 r/min 离心10 min，取上层清液，-80℃下储存待检。采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 表达水平，所用试剂由美国R＆D 公司提供，试剂均在有效期内，首先将特异性抗体与固相载体结合成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质，加受检标本，保温反应，形成固相抗原抗体复合物，再洗涤除去其他未结合物质，加酶标抗体，保温反应，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，再次彻底洗涤未结合的酶标抗体；最后加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，利用酶标仪检测其450 nm的波长，根据5 点定标的标准曲线计算其浓度，线性范围为0.1～800.0 ng/ml，检测下限为0.1 ng/ml。（3）气道重塑情况评估。采用高分辨CT 评估气道重塑情况，于主动脉弓上缘扫至肺尖，以右上叶尖段支气管为观察点，检测支气管管壁厚度（T）、管壁面积（WA）、支气管管壁厚度与气管外径之比（WT%）、支气管管壁横截面积占支气道总横截面积的百分比（WA%）等指标，并分析与气道重塑的相关性，数值越大代表气道重塑越严重。本研究以WA%值作为气道重塑程度指标。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件分析所得数据，全部数据均符合正态分布，计数资料组间构成比、率的比较采用卡方检验；计量资料2 组间均数比较采用t检验，2 组以上均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，对2 组计量资料间的相关性进行Pearson 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺功能指标和基底膜厚度比较 轻度组、中度组、重度组的FEV1、FVC、PEF 水平显著低于对照组，而基底膜厚度大于对照组（P＜0.05），随着病情加重轻度组、中度组、重度组的FEV1、FVC、PEF 水平显著降低，基底膜厚度显著增加（P＜0.05）。见表1。

表1 轻度组、中度组、重度组与对照组肺功能指标和基底膜厚度比较（±s）

表1 轻度组、中度组、重度组与对照组肺功能指标和基底膜厚度比较（±s）

注：与对照组比较aP＜0.05，与轻度组比较bP＜0.05，与中度组比较cP＜0.05。FEV1 为第1秒用力呼气量，FVC 为用力肺活量，PEF 为最大呼气峰流速

组别对照组轻度组中度组重度组F 值P 值例数50 58 91 65--FEV1（%）92.39±16.87 80.47±10.15a 70.22±11.40ab 59.99±8.93abc 32.990＜0.001 FVC（%）95.87±17.71 81.84±12.76a 72.19±10.07ab 61.87±9.62abc 38.793＜0.001 PEF（%）113.85±21.26 89.03±11.68a 82.00±11.31ab 70.56±8.41abc 45.872＜0.001基底膜厚度（μm）2.49±0.71 4.23±0.91a 5.30±1.23ab 6.49±1.42abc 36.856＜0.001

2.2 各组痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比较轻度组、中度组、重度组的IL-25、HNP1-3、YKL-40水平显著高于对照组（P＜0.05），随着病情加重轻度组、中度组、重度组的IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平显著增高（P＜0.05）。见表2。

表2 轻度组、中度组、重度组与对照组痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比较（±s）

表2 轻度组、中度组、重度组与对照组痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比较（±s）

注：与对照组比较aP＜0.05，与轻度组比较bP＜0.05，与中度组比较cP＜0.05。IL-25 为白细胞介素-25，HNP1-3 为人中性粒细胞防御素，YKL-40 为人软骨糖蛋白-39

组别对照组轻度组中度组重度组F 值P 值例数50 58 91 65--IL-25（pg/ml）162.57±21.46 285.63±25.72a 366.23±33.03ab 453.75±40.63abc 53.862＜0.001 HNP1-3（ng/ml）216.59±15.84 420.07±21.43a 498.98±37.92ab 579.03±41.26abc 44.839＜0.001 YKL-40（ng/ml）38.52±4.17 45.93±7.73a 54.06±9.94ab 68.99±11.01abc 48.694＜0.001

2.3 痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平与患儿哮喘严重程度及气道重塑程度相关性分析 分别以PEF%值、WA%值代表哮喘严重程度及气道重塑程度，经Pearson 检验，痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平与患儿哮喘严重程度及气道重塑呈正相关。见表3。

表3 痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平与哮喘严重程度及气道重塑相关性分析

3 讨论

哮喘3 个主要病理改变为气道炎症、气道重塑和平滑肌功能紊乱，其中气道炎症是哮喘病理生理的基础，可进一步导致气道重塑和平滑肌功能障碍。在患儿气道炎症反应中，主要通过释放一些颗粒蛋白及白三烯和血小板活化因子等细胞因子使支气管收缩，从而导致气道损伤、气道反应性增加。患儿哮喘的临床表现与气道上皮结构密切相关，受损的上皮细胞不仅在气道重塑过程中起到重要作用，还在修复状态时分泌出多种细胞因子，如IL-25、白细胞介素-33（IL-33）等促进炎症反应的进展。本研究中发现，患儿痰中IL-25 水平显著高于健康对照组，并且随着病情的加重其水平显著增高。经Pearson 检验显示，其与患儿哮喘严重程度和基底膜厚度呈正相关。而上皮基底膜增厚是患儿早期气道重塑特征性病理变化，亦是气道重塑的重要内容。分析原因可能为IL-25 通过诱导辅助型T 细胞2（Th2 细胞）产生白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）以及白细胞介素-13（IL-13）等因子。由此可见，通过对不同细胞产生不同的生物学效应促进了哮喘患儿的气道炎症反应。

有研究发现，部分患者在治疗时尽管全身应用激素或白三烯调节，但哮喘炎症细胞仍然继续存在，其中以多形核白细胞（PMN）为多见，而HNP1-3主要分布在PMN 中，因此患儿哮喘时多种炎症细胞均可表达HNP1-3［9］。本研究通过检测对比各组之间HMP-13 水平，发现患儿痰中HMP-13 水平显著高于健康对照组，并且随着病情加重其水平显著增高。经Pearson 检验显示，其与患儿哮喘严重程度和基底膜厚度呈正相关。目前HNP1-3 在患儿哮喘中的具体病理机制尚不清楚。罗槑等［10］在研究中指出，HNP1-3 具有广谱抗菌活性，但当其浓度过高时会有细胞毒作用，释放到细胞外会引起组织损伤。赵劲波等［11］也在研究中指出，HNP1-3 可以介导上皮细胞释放炎症因子从而参与炎症反应。因此，在患儿哮喘过程中，HNP1-3 可能介导气道上皮细胞释放出大量趋化因子，从而参与气道炎症反应，并形成恶性循环。

随着对患儿哮喘的深入研究，炎症因子YKL-40 被发现。YKL-40 可由多种细胞分泌，目前其生物学功能尚未完全阐明，但多数学者认为YKL-40在免疫炎症反应、刺激血管生成以及抗细胞凋亡方面等起到重要作用［12］。本研究通过检测对比各组之间YKL-40 水平，发现患儿痰中YKL-40 水平显著高于健康对照组，并且随着病情加重其水平显著增高。经Pearson 检验显示，其与患儿哮喘严重程度和基底膜厚度呈正相关，与王聪慧［13］的研究结果基本一致。YKL-40 在患儿哮喘中的具体病理机制尚不清楚，但Ilmarinen 等［14］在研究中指出，YKL-40 在炎症反应中扮演了“哨兵”角色，其可以将嗜酸性粒细胞和T 细胞募集到感染部位，从而导致组织发生炎症、免疫、重塑。因此，在患儿哮喘过程中，YKL-40 可能通过介导炎症因子的表达分泌，参与患儿的免疫反应，调控微血管生成相关信号通路，促进了气道炎症反应的发生、发展。本研究中PEF%值、WA%值代表哮喘严重程度及气道重塑程度，经Pearson 检验，痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平与患儿哮喘严重程度及气道重塑呈正相关。这可能是哮喘发作期间气道内炎症会分泌大量的IL-25，引起机体免疫反应，造成多形核白细胞分泌大量的HNP1-3；此外，哮喘发病期间机体会进一步分泌YKL-40 来刺激血管生成、抗细胞凋亡，达到缓解哮喘的目的。然而，刘保华［15］在哮喘的研究中未见YKL-40 水平与患者病情有相关性，与本研究结果不符，可能与刘保华等人在研究时给予患者糖皮质激素治疗，从而影响了YKL-40 水平的表达有关。

本研究尚存在一定不足之处：（1）未能进一步对各指标基因、分子进行深入研究；（2）未能对各指标相关因子进行研究，如IL-4、IL-8；（3）未同时分析IL-25、HNP1-3、YKL-40 三者联合检测在诊断患儿哮喘严重程度及气道重塑中的意义等。后续仍需更多的基础研究进行验证。