柚皮素-mPEG-PLA聚合物胶束的制备及其体内药动学研究

王 丽， 黄一聆， 房 伟

(1.商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

柚皮素是一种广泛存在于芸香科植物中的二氢黄酮类成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化、抗炎、神经保护、预防动脉粥样硬化等活性[1-3]，但该成分属于生物药剂学分类系统中II类药物，口服吸收程度较差(吸收率仅约为5.8%)[1]，临床应用受到较大限制。目前，王章姐等[4]制备的柚皮素自微乳中乳化剂及助乳化剂用量较大，可能存在安全隐患；王元文[5]制备的柚皮素脂质体载药量仅为2.44%；赵涵等[6]制备的柚皮素纳米晶体粒径达到(400.7±6.9)nm，可能会限制其生物利用度提高程度[7]。

聚合物胶束是由两亲性聚合物的亲水性链段向水中伸展形成胶束的壳，而疏水性链段包裹难溶性药物后聚集形成胶束的核，从而形成的一种壳-核型的球形聚集体，粒径一般在10～100 nm之间[8-10]，具有良好的稳定性和较高的载药量[10]，并且其制备工艺简单，可有效提高生物利用度及药效[11-12]。聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物(mPEG-PLA)是一种生物相容性良好，可生物降解的聚合物载体，被FDA批准用于药物制剂、医学手术等领域，安全性较高。本实验制备柚皮素mPEG-PLA聚合物胶束，并对其体内药动学进行研究，以期为该成分新型口服制剂的开发提供参考。

1 材料

AR2140型电子天平[配置防风罩，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；安捷伦1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；HJ-4A型磁力搅拌器(山东欧莱博仪器有限公司)；VORTEX-5型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；RE5003型旋转蒸发仪(郑州科坤仪器设备有限公司)；FD-1C-50型真空冷冻干燥机(江苏恒敏仪器制造有限公司)；HNDK400型氮气吹扫仪(上海达洛科学仪器有限公司)；Master-sizer型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)。

柚皮素原料药(批号191005，纯度97%，苏州甫路生物科技有限公司)；柚皮素对照品(批号200110-2，纯度98.3%，上海纯优生物科技有限公司)；mPEG-PLA(批号20190630，分子量10 000 Da，山东岱罡生物科技有限公司)；甘露醇(批号D2108280，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

SD大鼠，体质量(300±20)g，雌雄兼用，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(豫)2016-0001。

2 方法与结果

2.1 柚皮素含量测定

2.1.1 色谱条件 Waters-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇-水(65∶35)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长288 nm；进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 称取柚皮素对照品50 mg，溶于100 mL甲醇中，制成质量浓度为500 μg/mL的贮备液，取适量用流动相依次稀释至20、10、5、1、0.5、0.1 μg/mL，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取聚合物胶束混悬液1 mL至100 mL量瓶中，适量甲醇超声处理2 min，取5 mL至10 mL量瓶中，流动相定容，即得。

2.1.4 线性关系考察 取“2.1.2”项下不同质量浓度对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=31.047 3X+1.088 5(r=0.999 9)，在0.1～20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 方法学考察 平行制备6份聚合物胶束供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得柚皮素峰面积RSD为1.70%，表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD为1.34%，表明溶液在24 h内稳定性良好。取“2.1.2”项下0.1、5、20 μg/mL对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得柚皮素峰面积RSD分别为0.93%、0.34%、0.22%，表明仪器精密度良好。取9份聚合物胶束混悬液至100 mL量瓶中，每份均为0.5 mL，分为3组，分别加入“2.1.2”项下贮备液1.0、1.25、1.5 mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素平均回收率加样分别为99.31%、100.66%、99.85%，RSD分别为0.94%、1.13%、0.88%。

2.2 包封率、载药量测定 取1 mL聚合物胶束混悬液至超滤管中(截留分子量为10 000 Da)，8 000 r/min离心10 min，收集续滤液，测定游离药量(W游离)。取1 mL聚合物胶束混悬液至100 mL量瓶中，适量甲醇超声处理2 min，取5 mL至10 mL量瓶中，流动相定容，测定总药量(W总)，计算包封率、载药量，公式分别为包封率=(1-W游离/W总)×100%、载药量=[(W总-W游离)/(W总+W总载体)×100%]，其中W总载体为载体总用量。再平行制备3批聚合物胶束，测得平均包封率为(86.76±1.81)%，载药量为(12.71±0.53)%。

2.3 粒径、Zeta电位测定 取0.5 mL聚合物胶束，蒸馏水稀释50倍，取3 mL至Master-sizer型粒度分析仪中测定其粒径、Zeta电位。

2.4 聚合物胶束制备 采用溶剂挥发法[9]制备。取柚皮素原料药25 mg，溶于无水乙醇中，再取处方量mPEG-PLA聚合物，溶于一定体积蒸馏水中，在转速1 000 r/min、温度45 ℃条件下缓慢加到柚皮素乙醇溶液中，在一定温度下持续旋蒸一定时间，0.22 μm微孔滤膜过滤，补充蒸馏水至原始水相体积，即得，密封。

2.5 单因素试验

2.5.1 mPEG-PLA用量 固定柚皮素用量25 mg，有机溶剂用量5 mL，水相体积20 mL，旋蒸温度30 ℃，旋蒸时间3.5 h，考察mPEG-PLA用量100、125、150、175 mg对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表1。由此可知，随着mPEG-PLA用量增加，包封率呈逐渐升高的趋势，而载药量逐渐降低，粒径逐渐减小；在175 mg时包封率升高、粒径降低程度均不明显，但载药量明显降低。最终确定，mPEG-PLA用量为150 mg。

表1 mPEG-PLA用量对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)Tab.1 Effects of mPEG-PLA consumption on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.2 有机溶剂体积 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg、水相体积20 mL，旋蒸温度30 ℃，旋蒸时间3.5 h，考察有机溶剂体积1、3、5、7 mL对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表2。由此可知，有机溶剂体积对包封率、载药量无明显影响，但随着其增加粒径有减小趋势。最终确定，有机溶剂体积为3 mL。

表2 有机溶剂体积对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)Tab.2 Effects of organic solvent volume on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.3 水相体积 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有机溶剂体积3 mL，旋蒸温度30 ℃，旋蒸时间3.5 h，考察水相体积10、15、20、25 mL对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表3。由此可知，随着水相体积增加包封率、载药量均呈先升高后降低的趋势，而粒径呈逐渐减小的趋势；在10 mL时包封率不足80%，粒径大于100 nm；在25 mL时包封率降低，可能是由于有机相扩散至水相的速度较快，聚合物来不及包载药物所致[13]。最终确定，水相体积为20 mL。

表3 水相体积对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)Tab.3 Effects of aqueous volume on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.4 旋蒸温度 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有机溶剂体积3 mL，水相体积20 mL，旋蒸时间3 h，考察旋蒸温度20、25、30、35、40 ℃对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表4。由此可知，旋蒸温度对胶束粒径影响不大，但随着其增加包封率、载药量先逐渐升高后降低，可能是由于高温会影响mPEG-PLA稳定性、聚合物胶束形成及稳定性所致[14-15]。最终确定，旋蒸温度为30 ℃。

表4 旋蒸温度对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)Tab.4 Effects of rotary evaporation temperature on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.5.5 旋蒸时间 固定柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有机溶剂体积3 mL，水相体积20 mL，旋蒸温度30 ℃，考察旋蒸时间2、2.5、3、3.5、4 h对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表5。由此可知，随着旋蒸时间延长，包封率、载药量逐渐升高后趋缓，可能是由于体系中有机溶剂未能完全除去，从而破坏胶束所致。另外，聚合物胶束自组装过程需一定时间[14]，但旋蒸时间过长时粒径增大，包封率、载药量有所下降。最终确定，旋蒸时间为3.5 h。

表5 旋蒸时间对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)Tab.5 Effects of rotary evaporation time on encapsulation efficiency, drug loading and particle size(n=3)

2.6 验证试验 根据单因素试验结果，确定最优制备工艺为柚皮素用量25 mg，mPEG-PLA用量150 mg，有机溶剂体积3 mL，水相体积20 mL，旋蒸温度30 ℃，旋蒸时间3.5 h。按上述优化工艺平行制备3批聚合物胶束(图1)，平均包封率为86.76%，载药量为12.71%，平均粒径为68.27 nm，PDI为0.181，粒径分布、Zeta电位见图2～3，可知两者分别为20～100 nm、-18.6 mV。

图1 聚合物胶束外观Fig.1 Appearance of polymeric micelles

图2 聚合物胶束粒径分布Fig.2 Particle size distribution of polymeric micelles

图3 聚合物胶束Zeta电位Fig.3 Zeta potential of polymeric micelles

2.7 形态观察 取聚合物胶束混悬液适量，蒸馏水稀释50倍后滴至铜网上，自然晾干后在透射电镜(TEM)下观察，见图4，首先发现固定胶形态，继续放大至15 000倍时即可发现具体形态，并且之间无粘连现象。

图4 聚合物胶束TEM图Fig.4 TEM image for polymeric micelles

2.8 冻干粉制备 取聚合物胶束混悬液适量，加入6%甘露醇振荡溶解，取3 mL至西林瓶中，平行制备若干份，置于-50 ℃冰箱中冷冻2 d，再迅速置于-25 ℃真空冷冻干燥机中3 d，即得，外观见图5，可知其外观饱满均一，无塌陷现象。复溶后，测得冻干粉包封率为81.79%，载药量为12.14%，平均粒径为79.65 nm，PDI为0.203，Zeta电位为-15.62 mV。

图5 冻干粉外观Fig.5 Appearance of lyophilized powder

2.9 体外释药研究 取柚皮素及其聚合物胶束冻干粉适量(均含8 mg柚皮素)，采用空白释药介质制备混悬液后置于溶胀后透析袋中(截留分子量8 000～12 000 Da)。文献[16]报道，柚皮素在水中的溶解度为74.52 μg/mL，在500 mL纯化水中可达漏槽条件，故本实验选择释药介质为500 mL纯化水(超声处理20 min)，转速、温度分别设置为100 r/min、(37±1)℃，于0、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24、48 h各取样4 mL，并补加4 mL纯化水，0.45 μm微孔滤膜过滤，测定累积释放度，结果见图6。由此可知，不同时间点聚合物胶束累积释放度均高于原料药，24 h内分别为59.17%、31.83%，48 h内分别为71.05%、33.67%。

图6 柚皮素体外释放曲线(n=6)Fig.6 In vitro release curves for naringenin(n=6)

2.10 体内药动学研究

2.10.1 分组、给药与取血 取柚皮素及其聚合物胶束冻干粉末适量，0.5%CMC-Na制成混悬液(柚皮素含量为3 mg/mL)。12只大鼠随机分为2组，每组6只，分别灌胃给予相应药物(20 mg/kg)，再用0.5 mL生理盐水冲洗灌胃针使药物完全进入胃内。原料药组大鼠于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h眼眶采血各约0.3 mL，置于肝素化离心管中，聚合物胶束组大鼠再增加12 h的采血点，血液3 000 r/min离心3 min，取上层血浆，密封后保存于冰箱冷冻层中。

2.10.2 样品处理 将“2.10.1”项下血浆室温解冻后精密量取100 μL，加入1.5%甲酸50 μL，密封，涡旋60 s，加入乙酸乙酯1 mL，涡旋60 s，4 ℃、10 000 r/min离心8 min，转移上清液至离心管中，设置温度为40 ℃，氮气吹干，得残渣，加入100 μL甲醇，涡旋10 s复溶，HPLC法测定柚皮素血药浓度。

2.10.3 方法学考察 取柚皮素对照品适量，甲醇稀释至1 200、600、300、100、50、20 ng/mL，分别精密吸取100 μL，40 ℃氮气吹干，得残渣，加入100 μL空白血浆，涡旋10 s复溶，即得血浆对照品溶液，按“2.10.2”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，以柚皮素峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=0.130 8X+7.951 4(r=0.990 5)，在20～1 200 ng/mL范围内线性关系良好。取20、300、1 200 ng/mL血浆对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得柚皮素峰面积RSD分别为9.07%、3.17%、5.14%，表明仪器精密度良好。取聚合物胶束灌胃给药1 h后的样品，于0、2、4、8、16、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD为10.24%，表明样品在24 h内稳定性良好。取1 200、300、20 ng/mL血浆对照品溶液，按“2.10.2”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得柚皮素加样回收率分别为91.69%、97.25%、94.88%，RSD分别为4.81%、7.26%、5.63%。

2.10.4 结果分析 柚皮素血药浓度-时间曲线见图7。t1/2、tmax组间比较采用非参数法秩和检验；Cmax、AUC0～t、AUC0～∞经对数转换后，组间比较采用DAS软件进行方差分析、双单侧t检验，结果见表6。由此可知，与原料药比较，聚合物胶束tmax、t1/2延长(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相对生物利用度提高至4.38倍。

图7 柚皮素血药浓度-时间曲线(n=6)Fig.7 Plasma concentration-time curves for naringenin(n=6)

表6 柚皮素主要药动学参数Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for

3 讨论

体外释药研究结果显示，柚皮素mPEG-PLA聚合物胶束增加了药物的释放量，可能是一方面胶束增加了疏水性药物的表面润湿性；另一方面药物粒径很小，大大增加了与水相的接触机会[17]；在6 h内约有35%的药物释放，可能是吸附在胶束表层的药物及部分游离药物释放所致(本实验未将游离药物除去)；6～48 h出现缓释现象，可能是药物与载体之间发生相互作用[18-19]，使前者稳定地存在于胶束内部，释放阻力较大。另外，虽然柚皮素mPEG-PLA聚合物胶束在不同时间点的释放度均高于原料药，但48 h内累积释放度仅为71.05%，仍未达到完全释放，可能会影响吸收程度。

体内药动学研究结果显示，柚皮素mPEG-PLA聚合物胶束tmax、Cmax、t1/2、AUC0～t、AUC0～∞与原料药相比均有显著差异(P<0.01)，表明该剂型明显改变了柚皮素药动学[12]；前者tmax延后，可能是胶束缓释作用所致，同时也影响了药物进入血液的循环时间，使t1/2发生显著性变化；Cmax升高，可能是因为胶束增加了药物溶解度[12,20]，提高了药物释放度；口服生物利用度提高至4.38倍，也与胶束对药物的保护作用有关，使药物免受外界环境的破坏[13]，增加了稳定性；较大的比表面积可使药物与胃肠道充分接触，有利于进入血液循环。

综上所述，本实验为柚皮素高效口服制剂的开发提供了借鉴，但其药效学能否得到提高尚不明确，还需作进一步研究。