玉米ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表达及抗体制备

张帅磊，赵天永

(西北农林科技大学 生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100)

玉米是世界上主要的谷类作物。由于干旱、高温等非生物胁迫会严重影响玉米种子的萌发和后期产量[1]，因此研究相关基因在不同组织、不同细胞以及不同逆境胁迫条件下的表达水平，鉴定抗逆基因的功能对通过生物技术育种提高玉米产量非常重要[2]。但确定相关基因的表达水平需要选择合适的内参基因，对目标基因的表达水平进行校正和标准化处理[3-4]。在糖酵解途径中发挥重要作用的三磷酸甘油醛(GAPDH)和构成微丝骨架的肌动蛋白(ACTIN)被广泛用于衡量目标基因的表达[5-8]。在植物中，GAPDH涉及花粉发育[9]、根系生长[10]、脂质代谢[11]和种子内油料的积累[12]，能够在一些组织和器官中稳定表达，这使其成为重要的内参基因之一。ACTIN广泛存在于真核生物中，其形成的微丝骨架是细胞生命的基础。高等植物中ACTINmRNA的表达高度稳定[13]，这为其作为内参基因奠定了基础。Schmidt等[14]利用实时定量PCR检测了烟草不同组织中8种潜在内参基因的表达，其中L25和EF-1α的表达稳定性最高。Huang等[15]对紫外线照射、激素刺激等条件下马蓝中10个候选内参基因的mRNA水平进行了评估，证明18S rRNA最为稳定。对欧洲油菜的8个候选内参基因进行鉴定表达发现，ACT7 mRNA在成熟胚胎中的变化相对稳定[16]。Cao等[17]发现，球藻在不同光强、不同温度处理下的最佳内参基因不同，其中ACT2在所有测试样本中的表达相对稳定。Zemp等[18]从白色剪秋萝的RNA-seq数据中选择了传统和新鉴定的共15个内参基因，利用实时定量PCR分析了生殖和营养组织中各个内参基因的表达差异，结果表明SL_ACTIN和SL_GAPDH在花蕾中的表达最为稳定，而在叶中SL_UBCE的表达最稳定。在进行基因表达研究时，需要有一个普遍表达的内部标准或管家基因作为参考，以准确衡量靶基因的表达程度[19]。近年来，实时定量PCR已被应用于分析内参基因的转录水平[20]，然而内参蛋白的表达分析一直被忽视。因此，本研究克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN，在原核细胞中表达相应的蛋白，制备其多克隆抗体，利用RT-PCR和Western blot分析了ZmGAPDH和ZmACTIN在热激下的转录和翻译水平，以期为进一步选择玉米中的内参基因提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料、菌株和载体 玉米B73自交系、大肠杆菌BL21(DE3)和RG2菌株、原核表达载体pET-28a，均为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 高保真DNA聚合酶、同源重组酶，购自Vazyme公司；限制性内切酶、植物总RNA提取Trizol试剂盒，购自Takara公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自Omega Bio-Tek公司；反转录试剂盒，购自Roche公司；弗氏完全佐剂和不完全弗氏佐剂，购自Sigma公司；PVDF膜，购自Millipore公司；HRP标记的羊抗兔抗体IgG，购自北京康为世纪生物科技公司；蛋白免疫印迹化学发光试剂盒，购自Zeta life公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。超声波细胞破碎仪(JY92-ⅡDN)购自宁波Scientz公司；核酸蛋白检测仪(Nanodrop 1000)，购自基因有限公司。

1.2 试验处理

试验于2020年11月至2021年3月在陕西杨凌西北农林科技大学进行。将玉米B73种子在蒸馏水中浸泡12 h，然后放在发芽纸上避光萌发3 d，随后在12 h光(28 ℃、(900±54) μmol/(m2·s))/12 h暗(25 ℃)条件下水培14 d至三叶期。将三叶期幼苗转入12 h光(42 ℃、(900±54) μmol/(m2·s))/12 h暗(42 ℃)的培养箱中进行热激，分别在热激后0，2，4和8 h采集地上叶片。

1.3 方 法

1.3.1 ZmGAPDH和ZmACTIN与其他植物中同源蛋白的氨基酸序列比对 玉米及其他植物GAPDH和ACTIN的氨基酸序列通过phytozome 网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)搜索得到，并使用DNAMAN 7软件进行氨基酸序列比对。

1.3.2 总RNA的提取、目的基因片段的克隆和RT-PCR扩增 使用Trizol试剂盒从三叶期玉米B73叶片中提取总RNA[21]。通过1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 1000分光光度计确定RNA的完整性、浓度和纯度。使用反转录试剂盒获得cDNA，然后用DEPC-水稀释50倍，用作基因克隆和RT-PCR的模板。利用 Primer 5.0软件设计用于克隆和RT-PCR的引物。ZmGAPDH-F(5′-ATGGGT-CGCGGATCCATGGGCAAGATTAAGATCGGA-ATC-3′)和ZmGAPDH-R(5′-TGCGGCCGCAAG-CTTCTGGGTCTTGAACATGTGGCG-3′)用于扩增ZmGAPDH的CDS序列，ZmACTIN-F1(5′-ATGGGTCGCGGATCCATGGCTGACGAGGAT-ATCCAGC-3′)和ZmACTIN-R1(5′-TGCGGCCGCAAGCTTGAAGCACTTCATGTGGACAATGC-3′)用于扩增ZmACTIN的CDS序列。为便于连接载体，引物中包含了限制性内切酶位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。ZmGAPDH-RTF(5′-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3′)和ZmGAPDH-RTR(5′-AACCTTCTTGGCACCACCCT-3′)用于ZmGAPDH的RT-PCR,ZmACTIN-RTF(5′-CTATCCAGGCTGTTCTTTCGTT-3′)和ZmACTIN-RTR(5′-TCAGGCATCTCGTAGCTCTTCT-3′)用于Zm-ACTIN的RT-PCR,ZmRAFS-RTF(5′-CGTGGGACGCCTTCTACCT-3′)和ZmRAFS-RTR(5′-CCCTGCTTGTACTCCCTGAAC-3′)用于对照玉米棉子糖合成酶基因(ZmRAFS)的RT-PCR。

1.3.3 目的基因原核表达载体的构建 将原核表达载体pET-28a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切，割胶回收,同时将扩增成功的ZmGAPDH和ZmACTIN目的片段割胶回收，使用同源重组的方法连接目的片段与载体。使用热激方法将pET-28a-ZmGAPDH重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，将pET-28a-ZmACTIN重组质粒转化大肠杆菌RG2，将pET-28a空载体转化大肠杆菌BL21和RG2作为对照。通过菌落PCR和酶切鉴定阳性克隆,将阳性单菌落测序验证。

1.3.4 重组蛋白的诱导表达及透析纯化 分别挑取测序成功的阳性单菌落和对照于含50 μg/mL卡那霉素的30 mL液体LB培养基中，37 ℃、165 r/min 培养至OD600为1.0，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，继续培养14 h。分别收集1 mL诱导前和诱导后菌液，4 ℃、12 000g离心1 min，弃上清，加入40 μL 1×PBS悬浮菌体、10 μL 5×loading buffer(1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)、质量分数10%十二烷基磺酸钠、质量分数0.5%溴酚蓝和体积分数50%甘油沸水浴15 min，取5 μL用8% SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的诱导表达情况。

小规模表达成功后，将菌株按1∶100的体积比转接到150 mL含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，按照原条件进行目的蛋白的大规模诱导表达。常温下8 000g离心10 min收集菌体，去上清，用10 mL 1×PBS悬浮菌体，再用超声波细胞破碎仪破菌30 min，功率180 W，间隔4 min,破菌3 min。用2 mL EP管收集菌体，4 ℃、12 000g离心10 min，去上清，每管菌体用80 μL 1×PBS悬浮，加入20 μL 5×loading buffer沸水浴15 min。用SDS-PAGE蛋白凝胶对悬浮菌体中的蛋白粗提物进行分离，利用0.25 mol/L KCl对整个蛋白胶进行负染，割取目的条带置于含Tris-glycine缓冲液(25 mmol/L Tris(pH 12.5)、250 mmol/L甘氨酸、0.5%(质量分数)十二烷基磺酸钠)的透析袋中进行电泳，纯化回收蛋白。取40 μL纯化蛋白，加入10 μL 5×loading buffer沸水浴15 min，取5 μL用8% SDS-PAGE电泳检测透析纯化后的重组蛋白，并进行考马斯亮蓝(CBB)染色。

1.3.5 抗体血清制备及验证 用蛋白免疫家兔产生ZmGAPDH和ZmACTIN的多克隆抗体。每隔14 d对家兔接种1次，共接种4次。初次免疫采用纯化的蛋白(200 μg)与500 μL弗氏完全佐剂混合液;之后3次免疫用纯化的蛋白(100 μg)与500 μL弗氏不完全佐剂混合液。在第4次免疫后7 d抽取家兔心脏血采集血清。

分别取40，4，0.4，0.04 ng的ZmGAPDH蛋白和ZmACTIN蛋白进行8% SDS-PAGE电泳。以制备的多抗血清(1∶5 000稀释)为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG(1∶20 000稀释)为二抗，进行Western blot检测。

1.3.6 提取植物总蛋白和多克隆抗体特异性检测 取热激后的玉米B73三叶期叶片0.2 g，放入液氮中研磨至粉末后装入1.5 mL EP管中，分别加入250 μL蛋白萃取液(50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L乙二胺四乙酸(pH 8.0)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、2%(体积分数)β-巯基乙醇)，4 ℃、16 000g离心15 min，使用Bradford’s assay方法测定上清中的蛋白浓度[22]。Western blot鉴定ZmGAPDH蛋白和ZmACTIN蛋白的表达水平[23]。以制备的多抗血清(1∶5 000稀释)为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG(1∶20 000稀释)为二抗。检测ZmRAFS、ZmACTIN和ZmGAPDH时的Western blot 总蛋白上样量分别为60，6，6 μg，用30 μg总蛋白进行CBB染色。

2 结果与分析

2.1 ZmGAPDH和ZmACTIN与其他植物的氨基酸序列比对

ZmGAPDH与其他植物同源蛋白的氨基酸序列相似度为84.00%～97.63%，其中与水稻、拟南芥、大豆、高粱、棉花、谷子和小麦中GAPDH的氨基酸序列相似度分别为92.28%，84.00%，85.00%，97.63%，87.24%，94.66%和94.36%(图1-A)。ZmACTIN与其他植物同源蛋白的氨基酸序列相似度为91.76%～99.20%(图1-B)。

这一结果表明，GAPDH和ACTIN在植物中都极为保守，推测利用玉米的GAPDH和ACTIN序列制备的抗体可能也适用于检测其他植物中GAPDH和ACTIN蛋白的表达。

2.2 pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN原核表达载体的构建

以玉米B73的cDNA为模板，利用1.3.2中设计的特异性引物，扩增得到1 014 bp 的ZmGAPDH目的片段和1 131 bp的ZmACTIN目的片段(图2)。

将目的片段连接至表达载体pET-28a后，挑取阳性克隆提取质粒，经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切验证得到5 300 kb的质粒骨架和1 014 bp的Zm-GAPDH预期片段。因为在ZmACTIN编码区序列中有1个Hind Ⅲ限制性内切酶位点，所以双酶切pET-28a-ZmACTIN重组质粒得到长647 bp和484 bp 2条条带(图3)。经测序结果正确，说明成功地将ZmGAPDH和ZmACTIN的完整编码区克隆到了原核表达载体pET-28a中。

2.3 重组蛋白ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表达及透析纯化

ZmGAPDH和ZmACTIN重组蛋白的诱导表达结果见图4。

通过SDS-PAGE检测转化菌株的溶菌产物(图4-A)，CBB染色发现转化空载体的菌液中无目的蛋白；与诱导前相比，在诱导后含重组载体的菌液中发现目的蛋白。其中ZmGAPDH蛋白分子质量约为41 ku,ZmACTIN蛋白分子质量约为46 ku，均与预测相符。由于目的蛋白条带清晰可见，表达量高，可以通过透析纯化的方法收集蛋白。CBB染色表明纯化的蛋白浓度较高，条带单一(图4-B)。

2.4 ZmGAPDH和ZmACTIN多克隆抗体免疫印迹检测

将多克隆抗体血清按照1∶5 000稀释，ZmGAPDH和ZmACTIN重组蛋白互为对照,结果(图5)显示，40 ng无关蛋白只能检测到微弱信号，但目的蛋白低至4 ng时检测信号仍非常强烈，这表明抗体的特异性很好。

2.5 多克隆抗体对植物内源性蛋白的特异性检测

为了验证ZmGAPDH和ZmACTIN作为内参基因的有效性，以玉米棉子糖合成酶基因ZmRAFS为对照，检测了热激条件下三叶期玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表达情况。结果发现ZmGAPDH和ZmACTINmRNA的丰度在叶片中较稳定(图6-A)，并且热激也未诱导ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白的积累(图6-B)。通过1%的琼脂糖凝胶发现提取的总RNA完整且无降解现象；CBB染色表明每个泳道总蛋白的上样量一致。说明ZmGAPDH和ZmACTIN可以用作内参基因研究热激条件下目标基因的表达水平。

3 讨 论

原核表达系统通常用于制备抗体，其中pET质粒是最常用的载体。然而目标蛋白的表达水平有时会很低，这除与诱导条件如温度、OD值、IPTG浓度有关外，还可能与目标蛋白本身的性质有关[24]，这就需要融合标签进行亲和纯化。在本研究中，目的蛋白表达水平高，可能是目的基因在植物体中本身为组成型表达所致。因此，本研究使用更为简单的透析纯化技术来获取蛋白。

大多数通路的合成酶基因(如ZmRAFS)是通过蛋白来发挥功能[25]，仅使用实时定量PCR归一化基因的表达会显得有失偏颇。本研究制备了ZmGAPDH和ZmACTIN抗体，并检测热激胁迫下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白的表达，发现目标蛋白在不同处理条件下表达水平一致，说明其均不响应热激。ZmGAPDH和ZmACTIN可以作为内参基因用于热激条件下玉米相关基因表达水平的检测，这为植物中内参蛋白的表达分析提供了参考。但ZmACTIN抗体检测到的ZmACTIN蛋白主带只存在微弱带条，就此结果而言，ZmGAPDH抗体的检测效果较 ZmACTIN抗体好。