嫁接西瓜在不同营养胁迫下最适内参miRNA的鉴定

胡仲远 陈淑娜 吴维芳 张明方

目的与意义： miRNA在调控植物生物与非生物抗性中具有重要作用，而嫁接是提高西瓜对逆境抗性的重要技术措施。在嫁接诱导的西瓜营养胁迫响应能力改变过程中的功能有待研究揭示。基因表达分析是探究在miRNA介导的分子调控机制的一种重要的手段，选取合适的内参基因来排除误差是取得可靠的表达结果的前提。由于分子结构和表达特征的相似性，miRNA或者其它小分子RNA比较适合作为miRNA表达分析的内参。因此，本研究旨在筛选出在正常养分条件和氮，磷营养胁迫下，以及在嫁接西瓜接穗和砧木（南瓜，葫芦）中进行miRNA定量分析的内参基因，为研究miRNAs在嫁接西瓜中调控养分胁迫响应中的功能奠定基础。

材料与方法： 以西瓜‘早佳为接穗，以葫芦‘甬砧1号和南瓜‘非常辅佐为砧木。西瓜嫁接、自嫁和实生苗培养在 Hoagland营养液（7.5 mmol·L-1 氮和0.3 mmol·L-1 磷， pH=6）中，炼苗5 d后，分别进行低磷（0.01 mmol·L-1）和低氮 （0.75 mmol·L-1）处理。胁迫5 d后取相应的叶片和根系样品用于miRNA表达分析。本研究共选取了17个候选内参基因，包括：选自嫁接西瓜苗的小RNA测序中发现的嫁接前后稳定表达的7个miRNAs （miR81，miR82，miRl66b，miRl70，miR3511-3p，miR319b，miR398b 和 miRl66u），其他物种中已经报道的内参miRNA的葫芦科同源miRNAs（miRl69n-5p，miRl67， miRl67c，miRl67b 和 miRl60a）和2个编码蛋白质的内参基因YLS8和PP2A以及常用的非编码RNA（U6和18S）。数据分析主要通过：1）使用软件StepOne v2.3计算每条引物的扩增效率（E）和相关系数（R2）。2）使用软件geNorm和NormFinder分析每个内参基因的稳定性。3）使用从嫁接西瓜的小RNA数据库中挑选出一個响应营养协迫的miR85 验证待选内参的可靠性。

结果与分析： （1）miRNA表达分析中的一些miRNAs（miR167c，miR167f和miR166b）的稳定性通常都高于蛋白质编码基因（YLS8和PP2A），说明它们更适合嫁接和养分胁迫下做矫正miRNA表达分析的内参。（2）没有单一内参可以在不同物种和不同养分情况下都保持稳定性。miR167c或miR166b是在正常养分条件下接穗和砧木中最稳定的内参。miR167c和miR167f是在低氮或低磷胁迫下的西瓜和南瓜样品中最稳定的内参，而miR166b是营养胁迫下的葫芦样品中最稳定的内参。（3）miR85的矫正结果表明使用最优的内参基因和最优的内参组合矫正得到的定量结果与使用最差的内参得到的结果差异显著。通过将不同内参矫正结果与高通量测序数据比对，发现miR166b和miR167c可分别作为正常养分条件下的嫁接西瓜接穗和砧木中合适的内参基因。（4）在嫁接西瓜中的多物种共生特性使用单个内参通常会使定量结果发生一定程度的变化，建议使用最优内参组合矫正表达分析结果。

结    论： miRNA更适合作为嫁接和养分胁迫下做矫正miRNA表达分析的内参。miR167c，miR167f和miR166b适合作为嫁接西瓜及养分胁迫下做矫正miRNA表达分析的内参基因。