主成分分析法优化柠檬果酒发酵工艺

殷小雪，杜慧慧*，陈焕，秦洪文，江鸿翎，刘行

重庆三峡学院生物与食品工程学院（重庆 404120）

柠檬[Citrus limon（L.）Burm.f.]属于芸香科柑橘属常绿小乔木，喜温耐阴不耐寒[1]。根据联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）数据库统计，2019年中国柠檬种植面积约16万 hm2[2-3]。万州区位于长江上游结合部，三峡库区腹地，气候冬暖夏凉，适合栽植柠檬。万州作为中国重要的柠檬三大产区之一，已有60年的种植历史，2020年种植面积达0.67万 hm2以上[4]。柠檬中不仅富含多种维生素，还含有大量柠檬酸，其果汁中维生素C含量达76 mg/100 mL。柠檬具有杀菌、美容、稳定情绪、提神、化痰止咳、生津健胃、降低胆固醇、促进牙齿生长、防止牙龈出血、预防坏血病和心血管动脉硬化等功效[5-7]。

由于感官评定易受评价人员的主观影响，导致感官结果误差大，故采用模糊数学法与感官评价相结合，使感官指标数字化，保证结果的科学可靠[8-9]。另外，食品品质影响因素众多，可通过主成分分析法（PCA）对主要因素进行分析，并建立数学模型，从而得到的产品综合评价更加准确[10-11]。

试验以三峡库区尤力克柠檬为主要原料，应用模糊数学感官评价法从色泽、香气、滋味和风格4个方面真实客观评价柠檬发酵酒，对柠檬发酵酒模糊感官评分、酒精度、总糖含量、总酸含量等进行主成分分析，建立综合评价模型，并结合正交试验优化柠檬酒酿造工艺流程，为柠檬的深加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尤力克柠檬（重庆市万州区横山村采摘）；安琪耐高温酿酒高活性干酵母（食用级，安琪酵母股份有限公司）；白砂糖（永辉超市购买）；玻璃层析柱（30 mm×500 mm，宸乔科技有限公司）。

1.2 试验试剂

β-环状糊精（食品级，浙江一诺生物科技有限公司）；大孔弱碱性阴离子交换树脂（D318、D301G、D301、D315）、弱碱性环氧系阴离子交换树脂（330，郑州和成新材料科技有限公司）；DNS试剂（化学纯）、邻苯二甲基氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠、盐酸（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）。

1.3 仪器与设备

电子天平（瑞安市乐祺贸易有限公司）；pH-100型pH计（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；HT-512ATC型糖度计（上海丙牛科技有限公司）；果酒专用型酒精计（烟台帝伯仕自酿机有限公司）；精密膜过滤器（烟台帝伯仕自酿机有限公司）；电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；SP-756型可见光分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 工艺流程

柠檬鲜果→去皮、瓤、籽→灭菌→装罐→配料、接种→主发酵→后发酵→陈酿→澄清→过滤→装瓶

1.4.2 操作要点

选择完全成熟、无虫害、无霉烂的柠檬鲜果，40℃流水冲洗，将附着在柠檬上的土壤、微生物以及残留的农药清洗干净。剥去果皮、果瓤和籽，得到柠檬果肉。调整糖度，按一定的料液比装罐，装至发酵罐容积的80%。接入活化后的酵母溶液，搅拌充分。在25 ℃密闭环境下发酵。待发酵醪液面上升，表示主发酵开始，每日测定发酵罐中的各项理化指标。直至可溶性固形物及pH无变化时，主发酵结束[12]。经后发酵[13]，根据NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》放置于干净通风的贮酒室进行陈酿。随后添加澄清剂使柠檬果酒中的杂质沉淀，液体澄清；采用精密膜过滤器，去除细小杂质[14]。

1.4.3 理化指标测定

pH，参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH的测定》；可溶性固形物，按手持糖度计法测定；总糖含量，按DNS试剂法测定；总酸含量，按酸碱滴定法测定；酒精度，按酒精计法测定，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.4 模糊数学感官评价

设柠檬果酒的评价因素集合为U=（u1，u2，u3，u4），u1、u2、u3和u4分别代表柠檬果酒的色泽、香气、滋味和风格。建立评价评语集合。设柠檬果酒的评价评语集合为V=（v1，v2，v3，v4）=（90，80，70，60），v1、v2、v3和v4分别代表优、良、中和差4个等级，每个等级分别对应90，80，70和60分。通过采用强制决定法[15]确定柠檬果酒的权重集合W=（w1，w2，w3，w4）=（0.3，0.2，0.4，0.1），即色泽、香气、滋味和风格分别占比0.3，0.2，0.4和0.1。由10名评价人员按表1标准对柠檬果酒进行感官评价，假设柠檬果酒得分情况如表2所示。

表1 柠檬果酒感官评价标准

表2 柠檬果酒感官评价得分情况汇总表

1.4.5 矩阵变换及模糊感官综合评价

通过将表中数据进行转化即可得到柠檬果酒的模糊感官评价得分矩阵R。

令模糊感官的综合评分集合为Y，根据模糊变换原理Y=W×R，即矩阵变化如式（2）所示。

柠檬果酒的模糊感官评分为综合评分集合Y与评语集合V的乘积，即模糊感官评分T=Y×V[16]。

1.4.6 单因素试验

将柠檬果酒的基本条件设置为主发酵温度25 ℃、糖度25%、酵母添加量0.12%、料液比1∶0 g/mL、发酵时间15 d。按照上述试验流程及操作要点进行单因素试验，分别研究糖度（17%，18%，19%，20%和21%）、酵母添加量（0.08%，0.10%，0.12%，0.14%和0.16%）、料液比（1∶0，1∶0.1，1∶0.2，1∶0.3和1∶0.4 g/mL）和发酵时间（11，13，15，17和19 d）对柠檬果酒模糊感官评分的影响。

1.4.7 正交试验

采取小组评分法，确定10名评定人员进行模糊感官评定。以柠檬果酒的模糊感官评分作为评判标准，分析柠檬果酒的单因素试验结果，制定各因素正交试验水平（表3）。

表3 正交试验因素水平表

1.5 超高效液相色谱测定类黄酮含量分析

1.5.1 样品预处理

柠檬果酒充分摇匀，吸取1 mL提取液，过0.22 μm亲水性PTFE膜到2 mL进样小瓶，待测。

1.5.2 仪器条件

UPLC检测主要参考赵梓燕[17]的方法。具体方法：使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美国），以0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）作为流动相，梯度洗脱，分离条件为0～0.6 min，10%～20% B；0.6～5.0 min，20%～70% B；5.0～7.0 min，70%～90% A；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样体积1 μL；检测波长283 nm（黄烷酮）和330 nm（PMFs）。

1.6 数据分析

使用软件SPSS 20.0进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

糖度对柠檬酒模糊感官评分的影响如图1（A）所示。糖度20%时，其模糊感官评分值最高，其色泽、香气、滋味、风格都达到最佳。

酵母添加量对柠檬酒模糊感官评分的影响如图1（B）所示。酵母添加量0.14%时，其模糊感官评价分达到最高值。

柠檬果酒的模糊感官评分随着料液比变大呈现先增加后减小趋势，料液比1∶0.2 g/mL时，柠檬果酒模糊感官评分达到最大（图1C）。料液比的增加会使柠檬果酒的透明度、色泽逐渐变好。

当发酵时间小于15 d时，柠檬酒浑浊、无光，无明显的酒香，滋味偏酸涩，酒体风格不协调。当发酵时间大于15 d，柠檬酒色泽偏淡，滋味由于柠檬过度发酵而导致苦涩，柠檬果酒的模糊感官评分下降。由图1（D）可知，最适发酵时间为15 d。

图1 柠檬酒发酵中单因素结果

2.2 正交试验结果

由表4可知，5号试验产品的模糊感官评分最高，对应的试验组为A2B2C3D1，极差的结果显示RB＞RA＞RD＞RC，表明酵母添加量对产品的影响最大，糖度和发酵时间的影响程度次之，料液比对柠檬果酒的模糊感官评价影响最小。通过k值的大小可得到其最优比为A2B2C2D1。

表4 正交试验样品模糊感官评分

2.3 正交试验样品PCA综合得分正交结果分析

由表5可知，极差分析结果显示RB＞RA＞RD＞RC，结果表明各因素对柠檬果酒的PCA分析综合得分的影响程度为酵母添加量＞糖度＞发酵时间＞料液比。柠檬果酒的最优配方为A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、发酵时间13 d。正交试验的最优配方在正交试验组中，其PCA综合得分为0.94。对正交试验结果进行方差分析（表6）得到糖度、酵母添加量、料液比对柠檬果酒的PCA综合得分的影响极显著（p＜0.05）。表7显示不同发酵组的总酸、总糖和酒精度存在差异。

表5 PCA正交试验综合得分

表6 方差分析表

表7 柠檬酒感官指标和理化指标结果

2.4 试验验证结果分析

根据正交试验中k值的大小得到柠檬果酒的最优比为A2B2C2D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.2 g/mL、发酵时间13 d，通过主成分分析正交试验样品得到的柠檬果酒的综合得分最佳比为A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、发酵时间13 d，由于2组试验的基本条件不同，进行验证性试验每组做平行试验3次。经过感官评定，A2B2C3D1果酒色泽呈橙黄色、澄清透明，有明显的柠檬清香和酒香，香气协调怡人，酸甜适口、醇厚纯净、无异味，酒体协调，典型极佳风格良好，模糊数学感官评分82.63±0.09分，酒精度11.8%±0.2%vol；A2B2C2D1果酒色泽呈橙黄色、澄清透明，柠檬清香和酒香协调性一般，口感醇厚纯净，酒体协调，风格良好，模糊数学感官评分80.12±0.12分，酒精度9.5%±0.1%vol。经过验证性试验A2B2C3D1组从感官以及酒精度都优于A2B2C2D1组。

2.5 有效成分含量测定

将最优工艺发酵的柠檬果酒置于10 ℃条件下陈酿120 d，使用超高效液相色谱法测定发酵柠檬果酒中含有圣草次苷455.685 mg/L、芸香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奥司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L。

3 结论

由主成分综合评价模型和正交试验获得最优配方为糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、发酵时间13 d，其感官和酒精度较好，颜色呈橙黄色，澄清透明，具有柠檬清香和酒香，酒精度为11.8%±0.2%vol，且含有圣草次苷455.685 mg/L、芸香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奥司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L，具有较好的食用及保健价值。