QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱法同时检测茶叶中14种农药残留

朱颖洁，曹燕卿，毛 劼，张 康，董方霆，何 昆，王 娜

（国家生物医学分析中心，北京 100850）

我国是茶叶的发源地，也是茶叶生产和消费量最大的国家。由于茶树生长喜温暖潮湿环境、种植单一化、缺乏生物多样性的特点，较易发生病虫害，其规模化种植过程中离不开农药的使用，农药残留问题难以避免[1-2]。国家允许在茶叶上使用一些高效低毒的农药，在GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定了106项茶叶农药残留限量标准[3]。然而，由于部分商家追求利益盲目施加农药和化肥催生、茶农使用农药不科学等原因，食品安全监督检查中茶叶农残超标的情况时有发生，甚至屡有禁用高毒农药的检出，严重危害消费者安全与市场信心[4-5]。

近年来，农药残留分析方法向着快速、简单、灵敏、低成本、易普及的方向发展。液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法是最常用的农药多残留检测分析手段，具有高灵敏度、高通量、定量准确等优点[6-9]。由于茶叶样品基质复杂，含有大量的茶多酚、生物碱、色素和有机酸等物质，检测过程中会产生较强的基质效应，必须通过前处理净化以减弱对目标农药检测的影响[10-11]。茶叶农药残留检测中传统的样品前处理技术如固相萃取[12-13]、液液萃取[14]、基质固相分散萃取[15]等常需要多次净化步骤，操作较为繁琐和耗时。2003年美国农业部Anastasiadis等发布的QuEChERS法[16]，是液液萃取法与基质分散固相萃取法相结合形成的一种前处理方法，通常使用乙腈或含1%乙酸的乙腈提取，加入无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠（NaCl）除水，配合使用N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和十八烷基硅烷（C18）等进一步净化，对不同种类的农药均有较好的回收率，具有操作简单、快速高效、成本低廉的优点[17]，在果蔬[18-20]、食用菌[21]、中药材[22]等植物源食品的多农残检测中得到了广泛的应用。本研究的主要目的是开发一种基于QuEChERS前处理技术结合UPLC-MS/MS，同时检测茶叶中14种常见农药残留的高灵敏、快速检测方法，考察提取液组分、QuEChERS净化柱等对回收率的影响，确定了最优条件，并将方法应用于30种市售茶叶样品检测，以期为高效和准确地评价茶叶的质量安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

14种农药标准品（啶虫脒、涕灭威、克百威、内吸磷、灭线磷、吡虫啉、茚虫威、甲胺磷、灭多威、氧化乐果、甲基对硫磷、硫环磷、丙溴磷、噻虫嗪）（100 mg/L） 天津阿尔塔科技有限公司，于-20 ℃冰箱保存；30种茶叶包括不同种类绿茶（狮峰龙井、竹叶青、采花毛尖、西湖龙井、太平猴魁茶、桐城小花、绿杨春、清明茶高山绿）、红茶（武夷山红茶、祁门红茶、生态野生红茶、古树红茶、金骏眉）、白茶（牡丹王白茶、政和白茶、安吉白茶）、乌龙茶（铁观音、大红袍、老枞水仙、马头岩肉桂）、花茶（茉莉花茶、菊花茶、蒲公英玫瑰茶、玫瑰花茶）、普洱茶、青稞茶、刺五加茶等 购于当地超市和茶叶专卖店，西湖龙井和古树红茶按照《GB 23200.121-2021》所示LC-MS/MS方法检测未检出本研究涉及的14种农药，分别作为空白绿茶和红茶基质进行相关研究；QuEChERS盐包（含有6 g MgSO4，1.5 g乙酸钠） 北京绿绵科技有限公司；尼龙微孔滤膜（型号SHIMEN DISC，孔径0.22 μm） 日本SHIMADZU公司；乙腈、甲醇、甲酸 色谱纯，美国Fisher公司；甲酸铵、乙酸 分析纯，德国Merk公司；4种QuEChERS净化柱及其使用方法如表1所示。

图 1 14种农药的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram （TIC） of 14 pesticides

Q-Trap 6500质谱仪 美国AB Sciex公司；LC-30AD液相色谱仪 日本SHIMADZU公司；Centrifuge 5810R低温高速离心机 德国Eppendorf公司；QL-901涡旋仪 美国KYLIN-BELL LAB公司；破壁粉碎机 中国天喜公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 提取：称取1 g粉碎好的茶叶样品于50 mL离心管中，加入10 mL超纯水，涡旋振荡5 min，加入10 mL 1%乙酸-乙腈溶液，涡旋振荡30 s，加入QuEChERS盐包，涡旋振荡5 min，以9000 r/min离心5 min，得上清提取液。

净化：经过上述得到的上清液分别使用4种QuEChERS净化柱进行下一步净化处理，具体方法见表1。

表1 4种QuEChERS净化柱型号、成分及使用方法Table 1 Model, component and usage of four kinds of QuEChERS purification columns

1.2.2 溶液配制 混合标准溶液：取14种农药标准品溶液（100 mg/L）各100 μL于10 mL容量瓶，加入乙腈定容，得到浓度为1 mg/L的混合标准溶液，于-20 ℃冰箱保存。

空白基质溶液：称取1 g（精确至0.001 g）空白绿茶/红茶样品，按照1.2.1节进行提取和净化，得到相应的空白绿茶/红茶基质溶液，将该溶液置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

基质混合标准溶液1：用空白基质溶液将混合标准溶液稀释得到0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/L等系列质量浓度的基质混合标准工作溶液，用于确定方法检出限和定量限。

基质混合标准溶液2：用空白基质溶液将混合标准溶液逐级稀释得到质量浓度为1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基质混合标准工作溶液，用于做标准工作曲线，即基质匹配校准曲线。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：SHIMAZU Shim-pack Velox Biphenyl C18色谱柱（3 mm×50 mm，2.7 μm）。分别考察乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含2 mmol/L甲酸铵）、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含5 mmol/L甲酸铵）四种流动相对14种农药检测结果的影响。流动相洗脱程序：0～0.01 min，5% B；0.01～1.0 min，5%～40% B；1.0～3.0 min，40%～85% B；3.0～4.5 min，85%～95% B；4.5～8.0 min，95% B；8.01～10 min，95%～5% B。进样体积设置为5 μL；流速设置为0.3 mL/min；色谱柱柱温35 ℃。

1.2.4 质谱条件 离子源：ESI离子源；将14种农药混合标准溶液通过针泵进样方式进行质谱方法调谐，在ESI+和ESI-模式下进行扫描，优化各化合物的质谱条件；检测方式：多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源电压：5500 V；离子源温度：500 °C；气帘气：35 psi；雾化气：65 psi；辅助加热气：55 psi。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 基质效应 茶叶的基质较复杂，可能存在基质抑制或基质增强效应。分别用厂家1复杂基质净化柱处理所得的空白绿茶基质和1%乙酸-乙腈提取溶剂配制浓度为50 μg/L的14种混合农药标准溶液，重复测定3次，考察14种农药在绿茶中的基质效应。

基质效应（Matrix effect，ME）按下式计算：

式中：ME表示基质效应，%；Amatrix表示基质混合标准溶液中目标分析物的峰面积（A，peak area）；Aextraction表示提取溶剂混合标准溶液中目标分析物的峰面积。

1.2.5.2 方法的线性范围、检出限、定量限 采用基质匹配标准溶液建立标准曲线。按照1.2节描述配制质量浓度为1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基质混合标准工作液，以各个农药的峰面积为纵坐标，相应的浓度为横坐标，获得目标物农药的线性回归方程，分别以信噪比（S/N）为3和10时对应的空白样品添加浓度为检出限（Limit of detection, LOD）和定量限（Limit of quantification, LOQ）。

1.2.5.3 回收率和精密度 分别在空白绿茶和红茶样品中添加低、中、高浓度（100、500、800 μg/kg）农药进行加标回收率试验，各浓度平行试验6次，计算平均回收率及测定结果的相对标准偏差（RSD）。

1.2.5.4 实际茶样品检测 利用本文方法对市售的30种茶叶进行检测，分析其中14种目标农药的残留浓度。

1.3 数据处理

分别利用Analyst 1.7和Sciex OS 1.7.0软件进行数据采集及处理，Origin 9.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 色谱、质谱条件优化

使用SHIMAZU Shim-pack Velox Biphenyl C18色谱柱（3 mm×50 mm，2.7 μm），设定流速为0.3 mL/min，分别考察了以乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含2 mmol/L甲酸铵）、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含5 mmol/L甲酸铵）为流动相对14种农药检测结果的影响，梯度洗脱程序见1.2.3。结果表明，选用0.1%甲酸水溶液-甲醇（2 mmol/L甲酸铵）为流动相时，14种农药的响应值和峰形最好。14种农药的总离子流图见图1。

将14种农药的0.1 mg/L混合标准溶液通过针泵进样方式进行质谱方法调谐，在ESI+和ESI-模式下进行扫描。结果显示，14种农药的母离子均为[M+H]+模式。手动调谐优化14种农药母离子和子离子，选取两组灵敏度最佳的离子对作为定量离子对和定性离子对，获得最佳的碰撞电压和碰撞能量，最终得到MRM模式下14种农药优化的质谱采集参数如表2所示。

表2 14种农药的质谱参数Table 2 MS parameters of the 14 pesticides

2.2 提取方法选择

QuEChERS样品前处理主要由提取和净化两部分组成。在提取阶段，常用的提取溶剂有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、正己烷等。乙腈因最适宜于提取各种极性的农药残留，同时不会萃取出很多油性物质（如蜡、油性色素、脂肪等），且仅需加入盐便可实现与水相的分离，是目前使用最广泛的提取溶剂。研究表明，在乙腈中加入1%乙酸，并在盐析过程中加入MgSO4和缓冲盐CH3COONa可对绝大多数农药残留得到较高的回收率[23]。另外，对于含水量低的样品，通过先向样品中添加一定量的水，可弱化待分析物与样品基质之间的相互作用，使待分析物更易在萃取/分配过程中被充分提取[24]。

本研究首先向茶叶样品中加入适量水充分浸润，再分别使用乙腈及含1%乙酸的乙腈作为提取溶剂，震荡均匀后加入含6 g MgSO4和1.5 g CH3COONa的盐包，进行提取效果的比较，结果表明（图2），采用1%乙酸-乙腈作为提取溶剂时，其农药回收率高于乙腈作为提取溶剂，因此，本文选择1%乙酸-乙腈作为提取溶剂。

图 2 不同提取液对目标化合物回收率的影响Fig.2 Effect of different extracts on target compound recovery

2.3 净化方式优化

茶叶样品基质复杂，其中的茶多酚、咖啡因、色素、有机酸等物质易和待测目标物共提取，干扰检测的准确性和灵敏度[6]。常见的净化剂有无水MgSO4、PSA、GCB和C18等。无水MgSO4能除去提取液的少量水分，PSA可有效去除脂肪酸、有机酸、一些极性色素和糖类，GCB能有效去除具有平面结构的甾醇和色素类杂质，C18吸附剂对油脂的去除效果十分明显[25]。另外，一些新型净化材料如多壁碳纳米管（MWCNTs）和石墨烯等因被证实能有效去除基质中色素类、糖类、氨基酸等干扰物，并在一定程度上改善GCB对部分平面结构化合物的吸附问题，也逐渐得到应用[26-27]。传统的净化方法是向提取液中加入一定量吸附剂，充分震荡使吸附剂与样品充分反应，最后离心去除吸附剂。为了使操作更加快速高效，本文使用将净化剂固相化的QuEChERS净化柱对提取液进行净化，省去震荡、涡旋和离心等步骤从而缩短了样品前处理时间。

本文考察了在空白绿茶和红茶样品中添加800 μg/kg目标化合物，采用两个厂家四种商品化QuEChERS净化柱（成分及含量见表1）对茶叶提取液净化效果和农药回收率的影响。如图3所示，由茶叶提取液经不同净化柱净化后的颜色深浅可初步判断，复杂基质净化柱对于色素杂质的净化效果好于简单基质净化柱，这是因为复杂基质净化柱中的GCB或MWCNTs对色素有很好的吸附作用。根据图4可知，对于绿茶样品，厂家1简单基质净化柱对14种农药的回收率（56.3%～91.1%）整体低于厂家1复杂基质净化柱（73.4%～112.4%），且色谱图中杂峰较明显（见图5），可见含有GCB（5 mg）的复杂基质净化柱能有效吸附色素等杂质，降低提取液中高浓度杂质对目标分析物检测的影响；绿茶样品经厂家2简单基质净化柱处理后对14种农药回收率（42.7%～79.3%）和经厂家2茶叶专用柱净化后对14种农药回收率（52.7%～71.2%）整体低于厂家1净化柱，说明厂家2两种净化柱中较高含量的MWCNTs（分别为15和45 mg）对目标化合物产生了一定吸附从而导致回收率降低。对于红茶样品，采用四种净化柱处理后14种农药回收率整体高于绿茶样品，且净化后样品颜色比绿茶浅，说明绿茶和红茶在茶多酚、生物碱、色素等成分上的差异会影响净化效果和检测结果，在实际检测中应根据样品具体情况进行优化。

图 3 绿茶和红茶经不同净化柱处理后茶叶提取液的颜色对比Fig.3 Comparison of green tea and black tea extracts using different purification columns

图 4 不同净化柱对目标化合物回收率的影响Fig.4 Effect of different purification columns on the target compound recovery

图 5 总离子流色谱图Fig.5 Total ion chromatograms （TIC）

综合考虑，本文使用净化效果和回收率都较好的厂家1复杂基质净化柱，进一步考察方法的基质效应、线性关系、回收率等，并对实际样品进行检测。

2.4 基质效应

茶叶中的茶多酚、生物碱、色素等易和目标物分析物共提取，难以通过净化全部去除，从而对目标分析物的离子化效率产生影响，即产生基质效应（Matrix effect，简称ME）[28-29]。我们分别用厂家1复杂基质净化柱处理所得的空白绿茶基质和1%乙酸-乙腈提取溶剂配制浓度为50 μg/L的14种混合农药标准溶液，重复测定3次，考察14种农药在绿茶中的基质效应。由表3可以看出，绿茶基质对14种农药的基质效应不同，10种农药ME＞105%，为基质增强；2种农药ME＜85%，为基质抑制；2种农药ME在85%～105%之间，表示无基质效应。因此，对茶叶农残检测，采用空白基质配制标准曲线进行定量分析以减弱基质效应的影响，提高定量结果的准确性。

表3 14种农药的线性方程、决定系数、检出限、定量限、基质效应和最大残留限量Table 3 Linear equations, coefficient of determination (R2), LODs, LOQs, matrix effects and the maximum residue limits of 14 pesticides

2.5 线性关系、检出限、定量限

由表3可知，14种农药在相应的线性范围内线性关系良好，R2＞0.99。以信噪比（S/N）为3和10时对应的空白样品添加浓度为检出限（Limit of detection,LOD）和定量限（Limit of quantification, LOQ），14种农药LOD在0.001～2.000 μg/L之间，LOQ为0.003～5.000 μg/L。根据GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》，除涕灭威在茶叶中的最大残留量未做规定，其余13种农药的检出限和定量限均远低于规定的最大残留量，说明本文方法满足实际检测需求。

2.6 回收率和精密度

如表4所示，在向空白绿茶和红茶样品中添加低、中、高浓度（100、500、800 μg/kg）三个浓度水平下，方法的平均回收率为71.2%～117.4%，RSD为1.1%～14.2%，说明该方法对绿茶和红茶中14种农药残留检测的准确度和精密度良好，能够满足茶叶样品多农药残留分析的要求。

表4 14种农药在绿茶和红茶中的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of the 14 pesticides spiked in green tea and black tea (n=6)

2.7 实际样品检测

利用本文方法对市售的30种茶叶进行检测，如表5所示，有6种茶叶检出目标农药，其中5种茶叶检出啶虫脒，残留量为2.4～14.1 μg/kg；2种茶叶检出克百威，残留量分别为1.9、23.0 μg/kg；2种茶叶检出吡虫啉，残留量分别为1.9、33.7 μg/kg；1种茶叶检出茚虫威，残留量为3.0 μg/kg；1种茶叶检出噻虫嗪，残留量为2.4 μg/kg。上述茶叶中农药残留均未超过国家标准GB 2763-2021规定的最大残留限量值。

表5 6种检出目标农药的茶叶中农药残留浓度（μg/kg）Table 5 Concentration of targeted pesticides detected in six tea samples

3 结论

本文采用QuEChERS前处理方法结合UPLCMS/MS技术，建立了茶叶中啶虫脒、涕灭威、克百威、内吸磷、灭线磷、吡虫啉、茚虫威、甲胺磷、灭多威、氧化乐果、甲基对硫磷、硫环磷、丙溴磷、噻虫嗪等14种农药残留的快速检测方法。通过优化提取液组分、QuEChERS净化柱种类等，14种农药的LOQ可达到0.003～5.000 μg/L，在3个添加水平下的回收率为71.2%～117.4%，能够满足茶叶农药残留限量指标的快速检测要求。对30种市售茶叶样品进行检测，其中6种茶叶检出目标农药，测得农药残留浓度均未超过国家限量标准。本文方法具有操作简便快捷、净化效果好、灵敏度和准确率高等优点，为高效和准确地评价茶叶的质量安全提供了新的参考。