狭鳕鱼片盐渍过程中品质及风味物质的变化

井月欣，张 晴 ，马长伟，张 健, ，李振铎，刘 昕，刘慧慧，赵云苹，王共明，刘 芳，曲 敏

（1.山东省海洋资源与环境研究院，山东烟台 264006；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100000；3.烟台三江水产有限公司，山东烟台 264006）

黄线狭鳕（Theragra chalcogramma）又称阿拉斯加狭鳕，是全球捕捞产量最高的鳕鱼品种，广泛分布于太平洋北部，包括美国阿拉斯加州、俄罗斯等。在我国，黄线狭鳕主要产于黄海东部。狭鳕具有很高的经济价值，它的蛋白质含量高，而脂肪含量低[1]，适合大规模工厂化加工生产。近年来，盐渍鳕鱼成为我国出口的鳕鱼加工新品，由于其风味独特、易保存，在欧美国家具有广泛的市场需求[2]。全球盐渍鳕鱼的消费总量每年约为24万吨，主要包括真鳕、狭鳕等种类。水产品腌制加工是一种常见的保藏方法，此法历史悠久、产品味道独特，深受广大消费者的喜爱。盐渍可以增加水产品的渗透压，降低水分活度，达到抑制腐败变质的作用。由于微生物和一些酶的作用，在盐渍过程中，水产品的品质和风味逐渐改变，产生了独特的风味[3]。

近年来，国内外研究者对腌制工艺的优化以及腌制对鱼肉品质和风味的影响进行了大量研究和探索。张建梅[4]发现腌制类食物容易产生亚硝酸盐自热污染的问题，污染水平一般低于20 mg/kg。陈娇娇等[5]研究了不同腌制条件对罗非鱼品质的影响，并优化了干腌工艺条件，发现腌制时间对鱼肉的氯化钠含量和氨基肽氮含量有显著影响，鱼肉的氯化钠含量与腌制盐度呈正相关。杨华等[6]研究了腌制对红鱼品质的影响，发现腌制方法和工艺条件均对腌制红鱼品质有显著影响。王腾等[7]研究了超声波辅助盐渍对鲩鱼理化性质和品质的影响，发现超声波可以缩短盐渍时间，抑制微生物的生长。Nguyen等[8]研究了不同盐水浓度对大西洋真鳕肌肉蛋白质构象的影响，发现盐浓度的增加促进了蛋白质的变性。曾令彬等[9]研究发现腌制和干燥使腊鱼中部分游离氨基酸含量增加，形成腊鱼特有风味。Esaiassen等[10]研究了腌制对鳕鱼感官品质的影响，发现腌制鳕鱼片的气味和口感比未腌制的鳕鱼更好。Rosa等[11]利用GC-MS测定了盐渍大西洋真鳕的挥发性成分变化，发现脂质和蛋白质的氧化有助于形成盐渍鳕鱼的特有风味。Barat等[12]分别用不同的盐水浓度腌制大西洋真鳕，发现在盐水浓度较高时，由于蛋白质盐析，鱼肉的蛋白质结构发生较大变化，产品含盐量较高且得率较低。Cui等[13]采用顶空-气相色谱-离子迁移技术（HSGC-IMS）对不同烹饪方法的鱿鱼样品的挥发性物质进行了测定，发现腌制鱿鱼具有独特的特殊风味化合物，不同的烹饪方法可以影响鱿鱼的香气。庞一扬等[14]发现鱼肉腌制前后的挥发性成分发生了明显变化，腌制过程中鱼肉的腥味成分减少，醛酮类、酯类物质增加。

目前，国内外学者对盐渍鳕鱼的研究以大西洋真鳕（Gadus morhua）为主，盐渍狭鳕的企业标准化加工以及品控缺少基础研究，对狭鳕在盐渍过程中发生的品质和风味变化研究甚少。因此，本文以狭鳕鱼片为原料，采用前期优化的盐渍工艺盐渍狭鳕鱼片，研究盐渍过程中狭鳕鱼片的品质变化，以期为加工出口型盐渍狭鳕产品提供理论支撑，并为鳕鱼深加工及其他鱼类加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

去骨去刺去皮狭鳕鱼片（重量为4～6盎司） 烟台嘉鸿食品有限公司；食用无碘盐 山东省盐业集团有限公司；正己烷（色谱纯）、三氯乙酸、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硫代巴比妥酸、冰乙酸、乙酸锌、亚铁氰化钾、硼酸钠、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、琼脂糖、盐酸、乙酰氯、无水甲醇、碳酸钾、甲醛、乙醇 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；总氨基酸测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；Lowry法蛋白浓度测定试剂盒、彩虹245广谱蛋白Marker 北京索莱宝科技有限公司；DNA抽提试剂盒 美国MP Biomedicals公司；DNA凝胶回收试剂盒 美国Axygen公司。

METTLER TOLEDO电子分析天平 瑞士/梅特勒托利多；DHG-9053A电热鼓风干燥箱 上海沙鹰科学仪器有限公司；HH-4电热恒温水浴锅 山东省烟台龙口市先科仪器公司；GC-2010高效气相色谱分析仪 日本岛津公司；Multiskan GO酶标仪

美国ThermoFisher公司；XW-80A旋涡混合器 上海精科实业有限公司；FlavourSpec®风味分析仪

济南海能仪器股份有限公司；YC-520L医用冷藏箱

中科美菱低温科技股份有限公司；DZQ真空包装机 上海阿凡佬机械有限公司；DHG-9053A电热鼓风干燥箱 上海沙鹰科学仪器有限公司；LEICA ICC50HD显微镜 德国莱卡公司；FD-2A冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 狭鳕鱼片预处理 采用注水法，在4 ℃下用纯水解冻狭鳕鱼片1 h，将其逐个清洗控干备用。

1.2.2 狭鳕鱼片盐渍工艺 采用干腌法，取漏网塑料筐（规格：37 cm×35 cm×3.5 cm）若干，底部用保鲜膜铺好，均匀地撒一层盐，再将狭鳕鱼片摆在塑料筐中，一层盐，一层狭鳕鱼片，每层盐都要均匀覆盖鱼肉表面，最后一层为盐，摆好后放置冷藏箱进行盐渍，盐渍条件为加盐量100%（w/w），盐渍时间15 d，盐渍温度10 ℃。分别在盐渍0、3、6、9、12、15 d取样，测定其脂肪氧化程度、亚硝酸盐含量、脂肪酸含量、游离氨基酸总量、蛋白质降解、微观组织结构和挥发性风味成分。

1.2.3 脂质氧化程度的测定 采用蔡文强等[15]的方法，并略作修改。将去除表面食盐的狭鳕鱼片研碎，准确称取10 g研碎后的鱼肉于锥形瓶中，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%的EDTA），用摇床振摇30 min后，双层滤纸过滤。取5 mL上清液于带塞比色管中，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，塞紧管口，沸水浴40 min，冷却至室温后，转移至离心管中，1500 r/min离心25 min。取上清液，加入5 mL三氯甲烷并摇匀，静置分层后取上清液，测定在532和600 nm波长处的吸光值，同时做试剂空白，平行测定三次，结果取平均值，用以下公式计算TBA值。

式中：A532、A600分别为在532、600 nm处的吸光值；155为丙二醛的毫摩尔吸光系数；72.06为丙二醛的分子量；m为称取的样品质量，g。

1.2.4 亚硝酸盐含量的测定 亚硝酸盐含量依据GB/T 5009.33-2016测定[16]。

1.2.5 脂肪酸含量的测定 参照谭青等[17]的方法，并稍作更改。将去除表面食盐的狭鳕鱼片真冷冻干燥，取100 mg冻干的样品于消化管中，加入2 mL 10%乙酰氯甲醇溶液（乙酰氯:无水甲醇=1:10）、1 mL正己烷，塞紧盖子后混匀。于80 ℃金属浴中甲酯化2 h，冷却至室温，加入5 mL 6% K2CO3、2 mL正己烷，振荡后静置10 min。取上清液，用0.22 μm滤膜过滤至脂肪酸测定小瓶，采用气相色谱仪分析，色谱柱为SP-2560气相色谱柱（100 mm×0.25 mm×0.2 mm），进样量为1 μL，根据脂肪酸标准品的保留时间进行定性。

1.2.6 游离氨基酸总量的测定 采用总氨基酸测定试剂盒的比色法进行氨基酸总量的测定；采用Lowry法蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度的测定。

1.2.7 SDS-PAGE电泳 参考刘家维等[18]的方法并作适当修改。制备分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，加入玻璃板中。将样品与5×上样缓冲液（40 μL+10 μL）混匀，沸水浴5 min后上样，样品上样量为10 μL，彩色245广谱蛋白Marker上样量为5 μL。以80 V的恒压进行电泳，当样品进入分离胶时，将电压改为120 V，待溴酚蓝跑到胶的底部时停止电泳。取出凝胶，使用考马斯亮蓝染液染色30 min后倒掉。用蒸馏水清洗凝胶2～3次，加入脱色液，放在摇床上振摇，每30 min更换一次脱色液，直至得到清晰的条带。随后，用凝胶成像分析仪进行拍照分析。

1.2.8 微观组织结构观察 根据沈晖等[19]的方法进行石蜡切片，并稍作修改。用手术刀片把样品切成3 mm×3 mm×3 mm的大小，配制含苦味酸饱和液（1.22%）75 mL、福尔马林25 mL、乙酸5 mL的Bolin氏液作为固定液，将样品置于固定液中固定23 h，置于70%乙醇中进行置换。随后将样品放入全自动组织脱水机中，进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明和浸蜡。浸蜡之后，用镊子取样，使用石蜡包埋机，于5 cm×3 cm×3 cm的纸盒内进行包埋，包埋后迅速冷却。修剪石蜡块，用旋转切片机切片，每片厚度为4 μm，取至少3片完整的连续切片，于40 ℃的水浴中展片，转移至载玻片，置于烘箱中（37 ℃）烘干。烘干的切片经脱蜡、苏木精-伊红染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片，盖上盖玻片，置于烘箱（37 ℃）烘片48 h，用电子显微镜观察、拍照。

1.2.9 挥发性风味成分的测定 采用HS-GC-IMS技术，使用FlavourSpec®风味分析仪测定盐渍狭鳕样品中的挥发性成分。称取2 g盐渍狭鳕样品，置于20 mL顶空瓶中，在60 ℃孵育15 min后，直接顶空进样，进样量为500 μL。参考Zhang等[20]的方法，设定分析条件见表1。

表1 HS-GC-IMS分析条件Table 1 Experimental conditions of HS-GC-IMS

1.3 数据处理

所有实验均重复3次，实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS23.0以及Microsoft Office Excel 2016完成数据的处理及分析。

2 结果与分析

2.1 盐渍过程中盐渍狭鳕鱼片脂质氧化程度的变化

在鱼腌制过程中，脂肪氧化对鱼类腌制产品的感官、风味、品质特性起着重要的作用[21]。由图1可知，随着盐渍时间的增加，鱼肉的TBA值由0.14 mg/kg升至0.26 mg/kg，呈缓慢上升趋势，说明脂质在盐渍过程中发生了氧化，此阶段主要是脂肪氧化酶的作用。TBA值均小于1.0 mg/kg，说明盐渍狭鳕鱼片的脂质氧化程度均在安全范围内[22]。

图 1 盐渍过程中盐渍狭鳕鱼片脂质氧化程度的变化Fig.1 Changes of degree of lipid oxidation of dry-salted Alaska pollock fillets during salting

2.2 盐渍过程中盐渍狭鳕鱼片中亚硝酸盐含量的变化

由图2可知，随着盐渍时间的增加，狭鳕鱼片中的亚硝酸盐含量呈先上升后下降的趋势，盐渍后亚硝酸盐含量由2.00 mg/kg增加到2.91 mg/kg，小于国标规定的30 mg/kg，说明盐渍使鱼肉中亚硝酸盐的含量增加，且在安全范围内[23]。由于鱼体本身就含有硝酸盐和亚硝酸盐，在盐渍前期，一部分硝酸盐被硝酸盐还原菌还原，生成亚硝酸盐，因此亚硝酸盐的含量升高；在盐渍中后期，亚硝酸盐被其他微生物还原成氮气、氨气等气体，而且由于盐渍后期鱼肉含盐量的升高，硝酸盐还原菌的活性受到抑制，因此亚硝酸盐的含量下降[24]。另外，由于盐渍狭鳕鱼片加工过程中未额外添加硝酸盐和亚硝酸盐，因此亚硝酸盐的含量总体处于较低水平。这与刘敏[25]的研究结果类似，在腌制过程中，鳓鱼的亚硝酸盐含量先增加后减少，且在腌制第6 d达到最大值。

图 2 盐渍过程中盐渍狭鳕鱼片亚硝酸盐含量的变化Fig.2 Changes of the content of nitrite in dry-salted Alaska pollock fillets during salting

2.3 盐渍对盐渍狭鳕鱼片脂肪酸含量的影响

采用气相色谱检测到盐渍过程中鱼肉20种脂肪酸含量的变化，结果见表2。在盐渍过程中，盐渍狭鳕鱼片的饱和脂肪酸总量略升高，其中硬脂酸（C18:0）含量最高，且在盐渍过程中（3、6、12、15 d）显著升高（P＜0.05）；单不饱和脂肪酸中，十五碳烯酸（C15:1）的含量最高，油酸（C18:1n-9c）含量仅次于十五碳烯酸的含量，且两者的含量在盐渍过程中呈升高趋势，说明脂肪酸水解的产物主要是十五碳烯酸和油酸；多不饱和脂肪酸中，DHA含量最高，其次是EPA，且两者的含量在盐渍过程中均呈下降趋势。以上结果表明脂质在盐渍过程中发生了氧化，且以多不饱和脂肪酸氧化为主。这与郭雅[26]的研究结果一致，在腌制过程中，风干鳊鱼的多不饱和脂肪酸含量减少，饱和脂肪酸含量明显升高。

表2 盐渍对盐渍狭鳕鱼片的脂肪酸组成及含量的影响Table 2 Effect of salting on fatty acid composition and content of dry-salted Alaska pollock fillets

2.4 盐渍对盐渍狭鳕鱼片中游离氨基酸总量的影响

由图3可知，随着盐渍时间的增加，狭鳕中游离氨基酸总量先急剧减小，再逐渐增加。这可能是因为盐渍前期水分的大量流失，导致游离氨基酸也跟着流失；盐渍中后期，鱼肉中蛋白质在蛋白酶、氨肽酶的作用下水解，生成了游离氨基酸，因此游离氨基酸总量逐渐增加。

图 3 盐渍对盐渍狭鳕鱼片中游离氨基酸总量的影响Fig.3 Effect of salting on the total free amino acids in drysalted Alaska pollock fillets

图 4 盐渍对盐渍狭鳕鱼片中蛋白质降解的影响Fig.4 Effect of salting on the protein degradation of dry-salted Alaska pollock fillets

2.5 盐渍对鱼肉中蛋白质降解情况的影响

由图4可知，随着盐渍时间的增加，在100～245 kDa之间的条带颜色明显变浅，说明大分子蛋白在盐渍过程中逐渐降解；肌动蛋白（48 kDa）在盐渍过程中（9～15 d）逐渐增加；分子量在20 kDa以下的蛋白发生部分降解。这可能是因为，在盐渍过程中，某些蛋白在高盐的作用下析出并降解，生成了分子量更小的蛋白片段，并进一步反应生成盐渍狭鳕鱼片的滋味物质[27]。盐渍的低温环境抑制了组织蛋白酶的活性，使蛋白质降解较缓慢。

2.6 盐渍对盐渍狭鳕鱼片微观组织结构的影响

在显微镜放大倍数为20倍时，狭鳕肌纤维横截面的微观结构如图5，可以看到盐渍前鱼肉肌纤维的横截面呈规则的长圆形且大小相似，细胞间隙较均匀；而随着盐渍时间的增加，肌纤维的横截面变得不规则，肌纤维明显收缩，细胞间隙先变大后变小。这些变化可能是由蛋白质盐析和肌肉结构成分的酶降解引起的。这与大西洋真鳕在盐渍过程中的微观结构变化相似，Thorarinsdottir等[28]研究发现，腌制使大西洋真鳕肌肉纤维收缩，且扩大了细胞间隙。

图 5 盐渍对盐渍狭鳕鱼片微观结构的影响Fig.5 Effect of salting on microstructure of dry-salted Alaska pollock fillets

2.7 盐渍对盐渍狭鳕鱼片中挥发性风味成分的影响

从图6和表3中对比分析可知，不同盐渍时间下狭鳕中的挥发性成分显示了较大差异（红色框区域）。可以看到，盐渍15 d后，壬醛、2-甲基丙醛、1-己醇、3-甲基-1-丁醇、异丙醇、乙酸丁酯、乙酸丙酯、2-丁酮、2,3-丁二酮、2-丙酮等物质的含量显著降低（P＜0.05）。其中壬醛主要来源于油酸的氧化，呈鱼腥味[29]；3-羟基-2-丁酮呈黄油味，2-丁酮呈辛辣味，为鱼类腐败的主要物质[30]，盐渍过程中这些物质的相对含量降低，说明盐渍降低了鱼肉的鱼腥味，且鱼肉的整体风味得到改善。随着盐渍时间的增加，庚醛、己醛、酯类、醇类物质等相对含量增加，其中，庚醛呈焦香味和油脂味，己醛呈青草味，均来源于亚油酸氧化，且阈值较低，盐渍过程中其相对含量均呈增加趋势，对盐渍狭鳕的风味起到了积极的作用；酯类、醇类物质相对含量均明显增加，其中，乙酸乙酯呈果香，且阈值较低，其相对含量在盐渍15 d后显著增加（P＜0.05），对盐渍狭鳕的风味起到了积极的作用。

图 6 不同盐渍时间下盐渍狭鳕鱼片挥发性成分指纹谱图Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds in dry-salted Alaska pollock fillets at different salting time

续表3

3 结论

本文采用加盐量100%（w/w），盐渍时间15 d，盐渍温度10 ℃的条件盐渍狭鳕鱼片，研究盐渍过程中狭鳕鱼片的品质变化。随着盐渍时间的增加，狭鳕鱼肉的TBA值由0.14 mg/kg升至0.26 mg/kg，亚硝酸盐含量由2.00 mg/kg增加到2.91 mg/kg，两者均在安全范围内。在盐渍过程中，盐渍狭鳕鱼片的饱和脂肪酸中硬脂酸（C18:0）和单不饱和脂肪酸中十五碳烯酸（C15:1）和油酸（C18:1n-9c）含量在盐渍过程中呈升高趋势，多不饱和脂肪酸中DHA和EPA含量在盐渍过程中均呈下降趋势，盐渍过程中以多不饱和脂肪酸氧化为主。随着盐渍时间的增加，狭鳕中游离氨基酸总量呈现先减少后增加，大分子蛋白在盐渍过程中逐渐降解，在100～245 kDa之间的条带颜色明显变浅，肌动蛋白（48 kDa）逐渐增加；在20 kDa以下的蛋白发生部分降解，肌纤维的横截面变得不规则，肌纤维明显收缩，细胞间隙先变大后变小。在盐渍过程中，盐渍狭鳕鱼片的腥味成分减少，酯类、醇类物质含量增加。关于狭鳕鱼片盐渍过程中微生物群对其品质的影响还需进一步研究探讨，以期为加工出口型盐渍狭鳕产品提供了理论支撑，并为鳕鱼深加工及其他鱼类加工提供了理论支持和参考。