肝器官芯片的研究进展

刘鑫磊，林铌，周晓冰，李波

·综述·

肝器官芯片的研究进展

刘鑫磊，林铌，周晓冰，李波

人体器官生物芯片是通过微流控技术，结合细胞生物学、工程学和生物材料等多学科，模拟人体组织器官主要结构和功能特征，在体外构建的微流体微生理系统[1]。与传统的毒理学动物实验相比，应用器官芯片更能反映人体内真实情况，避免了动物实验预测人体结果的差异；同时相对于静态培养替代方法，又能更好地体现出组织的敏感性和特异性[2-3]。此外，这种检测方式可以减少对研究动物的需要，符合减少、替代、优化的 3R 原则。

肝脏作为机体的代谢中枢，对药物的代谢发挥着重要作用，同时也成为药物毒性作用的重要靶器官，进入 I 期临床试验后因肝脏毒性导致的新药研发失败占到 90% 以上。最重要的安全问题之一是药物诱发的肝损伤，它可引起急性或慢性肝病，并且是药物从临床试验乃至市场撤出的主要原因。目前对肝损伤的不良预测通常是临床前阶段直接将不同物种的数据外推到临床阶段而得出的，但仍有约 30% 的药物性肝损伤无法预测[4]，因此开发高效、可靠、便捷的肝毒性预测模型是药物研发和安全性评价领域重点关注的难点和热点，正是这些迫切的需求，以及微流控技术的发展，催生了肝器官芯片的发展和应用研究[5]。为了使广大科研工作者更好地了解肝器官芯片，本文综述了近些年肝器官芯片的构建、与其他器官共培养多器官芯片及其应用的研究进展和面临的挑战。

1 肝器官芯片的构建

1.1 细胞系

在解剖学中，肝脏主要有四种细胞，分别是肝实质细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞、肝星状细胞。原代细胞和组织切片在短时间内可以保持起源时的形态和功能特征，但其寿命和扩张能力有限，难以用于高通量研究。细胞系有比原代细胞更高的复制能力和稳定的表型，可以长期使用，有助于可重复的研究，所以细胞系广泛应用于药物研发实验[6-7]。

HepaRG 细胞系诱导分化后可以表达较高的 CYP3A4 和 CYP2B6，其中 CYP3A4 是肝脏分泌最多的代谢酶，涵盖市面上三分之二的药物代谢；CYP2B6 仅占肝脏酶分泌的 5%，但可涵盖市面上 25% 以上的药物代谢，因此诱导分化的 HepaRG 细胞在体外肝脏模型建立过程中常用来代替肝实质细胞。在研究肝非实质细胞作用的过程中，可加入肝枯否细胞。枯否细胞是肝组织内的巨噬细胞，是单核吞噬细胞系统的一部分，由血液的单核细胞黏附于肝窦壁分化而形成的，可通过吞噬作用清除血循环的异物颗粒或衰老的红细胞、血小板、NK 细胞。肝枯否细胞和星状细胞均在肝脏的免疫防御以及肝纤维化、肝炎或脂肪性肝炎的病理生理中起着至关重要的作用。为了研究酒精诱导的脂肪肝中单个肝非实质细胞的病理生理过程，Deng 等[8]应用四种转化细胞系 HepG2 细胞、LX-2 细胞、EAhy926 细胞和 U937 细胞共培养以组成肝微流控芯片。

已建立的细胞系用于细胞培养和体外药物测试，但是这些细胞最初都是从肿瘤中获取的，可能并不能代表健康的肝功能，为了获得足够数量和适当功能性的肝细胞，人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）可作为体外类器官建立的常用细胞来源。Kamei 等[9]利用微流控装置建立了 hPSCs 肝分化的方法，在三维环境中诱导 hPSCs 进行分化，通过 CYP450 的表达和吲哚氰绿（ICG）排泄实验来判定肝细胞的成熟和功能。

1.2 常用模型

目前常用的肝类器官芯片模型主要有肝微球、三明治夹心模型。低吸附球形板和悬滴成球技术是培养肝微球常用的技术手段。常规的 2D 培养模式无法模拟人体复杂微环境以及细胞外基质的支持，3D 培养环境可以使细胞表面的黏附因子更加均匀地表达[10]。Bhise 等[11]用甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）模拟细胞外基质，将其与肝小球混合后，进行肝脏 3D 生物打印。实验表明，将细胞接种在 GelMA 微结构的表面生长状态良好，芯片腔室内用胶原包被有利于细胞的播种和培养[12-13]。芯片的多层设计可用于模拟药物吸收和排泄过程，在研究不同给药方案下药物吸收、代谢以及毒性反应方面具有巨大潜力。

在无菌、温度、pH 值、培养基和药物的流体流动等稳定培养条件下，Yu 等[14]设计了一种用于 3D 细胞培养的灌注-导管-肝脏芯片，以确保培养基在球状培养上的切线流动。肝细胞功能显著改善，并维持 14 天的恒定值(尿素、白蛋白合成和 CYP450 酶活性)。用双氯芬酸和对乙酰氨基酚重复给药的慢性药物反应进行评估，结果表明该动态培养比静态培养更敏感，生物芯片中白蛋白的产量提高了一倍。除此之外，在生物芯片上显示了一种特定胆汁酸的代谢。利用微流控网络模拟体内循环结构、各脏器体积比、门静脉至肝动脉血流比等生理参数，可构建适合于体内条件的体外药代动力学模型。

2 肝器官芯片与其他器官的共培养研究

微流控单器官芯片模型旨在重现该器官功能，虽然其可提供有关靶器官生理反应的有用信息，但却无法展现人体中不同组织和器官之间的相互作用。为了能够模拟相对复杂的人体生理反应和器官-器官相互作用，并开展疾病建模、药效评价、药物筛选等研究，在过去几年中出现了各种多器官芯片。

多器官联合培养会影响肝脏代谢的功能以及相关酶的表达量。肝肠共培养微流控芯片由肠上皮细胞和肝细胞两层独立组成，其设计目的可使药物在肠道培养室内依次吸收，在肝培养室内进行代谢反应。Chen 等[15]使用人原代肠细胞建立肝肠共培养模型，与单器官动态培养相比，共培养系统的细胞代谢率（尿素或白蛋白的产生）无显著变化，但 CYP 活性显著提高。Choe 等[16]将 Caco-2 和 HepG2 在芯片上培养时，也观察到两种细胞的 CYP450 代谢活性均显著增强，Caco-2 细胞的吸收性能也随之发生变化。肝肠共培养比单培养的代谢谱更接近于人体天然的代谢谱，这些结果显示了肝器官芯片在预测人类反应的临床前研究中的潜力。Yu 等[17]研究表明在多能干细胞衍生的内皮细胞和肝细胞共培养环境中，与静态对照相比，微流控芯片上检测到抗炎营养药物槲皮素代谢产物的水平更高，可以更显著抑制 IL-1β 介导的炎症。与静态培养相比，微流控培养可能具有更灵敏的生理反应。

多数药物进入人体后会经历吸收-分布-代谢-排泄过程。药物代谢动力学指体内药物浓度与时间的关系。药物效应动力学指体内药物浓度与作用效应强度的关系。动物实验主要进行的是终点分析，而微流控芯片可以做到实时跟踪监测。Bavli 等[18]在线粒体功能障碍研究中，能提供实时分析线粒体应激的早期指示物的微小转变。Marin 等[19]研究了对乙酰氨基酚在微流控条件下双器官芯片中的药代动力学特性。乙酰氨基酚的肠道吸收和肝代谢分别由人体的肠道和肝脏类器官模拟，肠屏障使用 Caco-2 和 HT-29 细胞构建，肝球体由 HepaRG 和 HHSteC 细胞构建（图1）。此外，有研究采用肝脏免疫活性共培养模型应用于双氯芬酸和氢化可的松的药物代谢动力学的研究，培养 48 小时后评估生物转化，主要 I 期和 II 期代谢物与人类体内代谢谱相似，所得结果接近人体实际值，表明该芯片可用于药物代谢动力学研究[20]。

肝脏与其他器官的活动密切相关，而微流控芯片可以使肝脏球形体与不同的人体类器官（如胰岛、皮肤穿刺活检、神经元球形体或肠道组织）进行共培养并在数周内保持稳态，对于药物的吸收代谢及毒性反应可以有更详细深入的研究[21-22]。多器官微流控芯片可用于癌症转移的研究，Kim等[23]利用 3D 微流体人体肝器官芯片研究细胞外囊泡在乳腺癌细胞肝转移中的作用。肝肾微流控芯片研究表明乳腺癌细胞转移有明显的肝向性，而非肾向性[24]。在药物毒性反应方面，Lin 等[25]利用微流控芯片进行肝肾共培养，通过环孢素 A 与利福平的联合使用证明构建了一种新型的、具有潜在优势的毒理学研究替代模型。Baert 等[21]首次建立了肝脏与睾丸的体外共培养，以研究药物经肝酶代谢后对其他器官的疗效及副作用（图2）。

图1 肝肠共培养芯片模拟口服给药

图2 肝脏与睾丸的体外共培养

此外，利用具有皮肤结构的心肝器官芯片可用于研究局部给药的药物毒性，这种有效的皮肤阻隔模型还可以对比急性和慢性药物的影响[26]。多种共培养模型显示出较为理想的代谢表征，有望成为药物筛选的重要模型。

3 肝器官芯片应用

由于肝器官芯片是基于充分了解人体的复杂组织器官结构和生理功能特点而构建的，所以这种近生理的体外模型在疾病建模，药物筛选、开发与安全性评价，肝毒性筛选，再生医学和个性化精密医学等领域具有巨大的应用价值和前景。本文仅列举药物研发与评价、疾病机制分析的研究进展。

3.1 药物评价研究

在药物有效性和安全性评价中，微流控芯片作为一个体外模型，虽然不能完全替代动物实验，但是器官芯片的重要优势在于构建它的细胞可直接来源于人，因此可以避免动物与人的种属差异。Ma 等[27]研制了一种集成的多层微流控装置，用于药物代谢产物表征和药物代谢诱导的细胞毒性分析。2012 年，Prot 等[28]在微流控生物芯片中培养的肝癌细胞的转录组、蛋白质组和代谢组学数据整合，更完整地重建对乙酰氨基酚损伤通路。这项工作是全球整合微流控生物芯片数据进行毒性评估的首例，证明了这种新方法在预测毒理学方面的潜力。

药物相互作用是药物研究中的重要因素，一种药物可以增加或降低与代谢另一种药物相关的代谢酶的活性，因此，它可以更快或更慢地降解次级药物，从而最终改变其治疗效果或毒性反应[29]。Ma 等[30]使用已建立的肝仿生微组织，研究临床药物之间的相互作用，结果表明，预先给予影响 CYP-1A1/2 或尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶活性的药物会改变后续给药药物的毒性作用。Vernetti 等[31]设计的微流控芯片系统可在连续介质灌注下维持约一个月，表现出稳定的代谢活性，包括长达 23 天的 I 期和 II 期药物代谢、蛋白质分泌、胆汁生成以及对各种有毒化合物的最终反应，证明了微流控芯片具有用于长期毒性研究的潜力。

在 CYP 酶活性较低的系统中，由于毒性代谢物的积累较低，发生药物肝毒性所需的剂量明显高于体内的真实血药浓度。因此，肝器官芯片具有高水平的肝毒性检测灵敏度。

3.2 疾病机制分析

微流控芯片可用于体内炎症的相关研究中。无论是单一培养还是与其他肝非实质细胞共培养的原代成人肝细胞（primary human hepatocytes，PHH），3D 肝器官芯片为研究具有生理宿主细胞反应的长期乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染提供了重大改进。除了促进药物功效研究，毒理学分析和发病机制研究之外，这些微流控培养系统还可以评估针对 HBV 感染的治愈性疗法，通过 PHH 单培养和 PHH/Kupffer细胞共培养的设置，进行被 HBV 感染的宿主反应分析。该方法适用于研究 HBV 的发病机制、治疗方案及其感染的长期影响[26, 32-33]。

非实质细胞在酒精性肝病的发生发展中起关键作用。然而，这种细胞行为在传统的体外酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)模型和动物模型中不便观察。Deng 等[34]开发了一种可拆卸的芯片式肝脏装置，用于研究酒精诱导的 ALD 中个体非实质细胞的病理生理过程。该肝脏装置由 HepG2、LX-2、EAhy926 和 U937 细胞在灌注下按生理分布顺序排列组成。该装置可以改善 HepG2 细胞的活性，维持包括白蛋白合成和尿素分泌在内的高肝功能。这种新型的肝脏装置能够重建酒精诱导的肝非实质细胞系的损伤过程，并通过测量不同类型肝非实质细胞系的多种生物标志物，包括 Ve-cadherin、eNOS、VEGF 和 a-SMA 来了解不同类型肝细胞在 ALD 期间的状态，可用于进一步的病理分析和药物及毒物筛选研究。

此外，Gröger 等[35]首次测试了低温下肝器官芯片维持细胞活性、组织形态和代谢转化活力的能力。此项系统研究中，使用组织保存液 TiProtec 低温保存肝器官芯片，能使其功能性维持 2 天，从而使肝器官芯片在生物医学领域中有更为广泛和灵活的应用。

4 展望

近年来，已经开发出各种体外肝脏系统以模拟肝功能和病理生理学，其中微流体设备可以精准控制生物力学、生化参数，从而在细胞、组织和器官水平上模拟人体内环境。但目前大多数器官芯片均处于研究阶段，在实际应用中仍有一些问题需要解决，包括如何建立更符合人体生理的肝器官芯片体系，实现多种器官的功能关联性和兼容性，如何实现肝器官芯片标准化和集成传感检测，以及如何推动器官芯片的法规认可及新药注册申报应用等。在材料层面上，肝器官芯片使用的某些聚合物（例如 PDMS）会吸收或释放化合物，特别是疏水性药物和激素，这可能会对肝毒性研究产生影响并使得药物筛选过程具有挑战性。在性能标准方面，需要制订完善的质量控制性能标准。器官芯片作为特殊的微流控技术与体外试验的结合，首先应按照 3Q 程序验证微流控系统的装置或设备；其次，应定义用于器官或疾病模型的每个细胞的质量标准，包括细胞来源、分化和适用范围等；最后，统一的性能指标以及读数的标准化对于确认芯片的生理相关性能也是非常必要的。在法规监管方面，证明使用芯片的测试结果与临床试验的结果平行对于监管批准至关重要，器官芯片的可靠性和相关性尚需进行充分的验证。因此，尽管肝器官芯片的研发目前已经取得了突飞猛进的发展，但仍需研发、商业及监管机构不断共同努力解决上述问题，以推进其在药物评价和研发中的实际应用。

[1] Wikswo JP. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med (Maywood), 2014, 239(9):1061-1072.

[2] Kimura H, Sakai Y, Fujii T. Organ/body-on-a-chip based on microfluidic technology for drug discovery. Drug Metab Pharmacokinet, 2018, 33(1):43-48.

[3] Lee SH, Ha SK, Choi I, et al. Microtechnology-based organ systems and whole-body models for drug screening. Biotechnol J, 2016, 11(6): 746-756.

[4] Jalili-Firoozinezhad S, Miranda CC, Cabral JMS. Modeling the human body on microfluidic chips. Trends Biotechnol, 2021, 39(8): 838-852.

[5] Esch MB, Ueno H, Applegate DR, et al. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip, 2016, 16(14):2719-2729.

[6] Ramboer E, De Craene B, De Kock J, et al. Strategies for immortalization of primary hepatocytes. J Hepatol, 2014, 61(4):925- 943.

[7] van Midwoud PM, Merema MT, Verpoorte E, et al. A microfluidic approach for in vitro assessment of interorgan interactions in drug metabolism using i ntestinal and liver slices. Lab Chip, 2010, 10(20): 2778-2786.

[8] Deng J, Zhang X, Chen Z, et al. A cell lines derived microfluidic liver model for investigation of hepatotoxicity induced by drug-drug interaction. Biomicrofluidics, 2019, 13(2):024101.

[9] Kamei KI, Yoshioka M, Terada S, et al. Three-dimensional cultured liver-on-a-chip with mature hepatocyte-like cells derived from human pluri potent stem cells. Biomed Microdevices, 2019, 21(3):73.

[10] Cukierman E, Pankov R, Yamada KM. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol, 2002, 14(5):633- 639.

[11] Bhise NS, Manoharan V, Massa S, et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication, 2016, 8(1):014101.

[12] Takeuchi M, Kozuka T, Kim E, et al. On-chip fabrication of cell-attached microstructures using photo-cross-linkable biodegradable hydrogel. J Funct Biomater, 2020, 11(1):18.

[13] Guo Y, Deng P, Chen W, et al. Modeling pharmacokinetic profiles for assessment of anti-cancer drug on a microfluidic system. Micromachines (Basel), 2020, 11(6):551.

[14] Yu F, Deng R, Hao Tong W, et al. A perfusion incubator liver chip for 3D cell culture with application on chronic hepatotoxicity testing. Sci Rep, 2017, 7(1):14528.

[15] Chen HJ, Miller P, Shuler ML. A pumpless body-on-a-chip model using a primary culture of human intestinal cells and a 3D culture of liver cells. Lab Chip, 2018, 18(14):2036-2046.

[16] Choe A, Ha SK, Choi I, et al. Microfluidic Gut-liver chip for reproducing the first pass metabolism. Biomed Microdevices, 2017, 19(1):4.

[17] Yu F, Goh YT, Li H, et al. A vascular-liver chip for sensitive detection of nutraceutical metabolites from human pluripotent stem cell derivatives. Biomicrofluidics, 2020, 14(3):034108.

[18] Bavli D, Prill S, Ezra E, et al. Real-time monitoring of metabolic function in liver-on-chip microdevices tracks the dynamics of mitochondrial dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113(16): E2231-E2240.

[19] Marin TM, de Carvalho Indolfo N, Rocco SA, et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chem Biol Interact, 2019, 299:59-76.

[20] Sarkar U, Ravindra KC, Large E, et al. Integrated assessment of diclofenac biotransformation, pharmacokinetics, and omics-based toxicity in a 3D human liver -immunocompetent co-culture system. Drug Metab Dispo, 2017, 45(7):855-866.

[21] Baert Y, Ruetschle I, Cools W, et al. A multi-organ-chip co-culture of liver and testis equivalents: a first step toward a systemic male re protoxicity model. Hum Reprod, 2020, 35(5):1029-1044.

[22] Materne EM, Ramme AP, Terrasso AP, et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnol, 2015, 205:36-46.

[23] Kim J, Lee C, Kim I, et al. Three-dimensional human liver-chip emulating premetastatic niche formation by breast cancer-derived extracellular vesicles. ACS Nano, 2020, 14(11):14971-14988.

[24] Tian H, Pang J, Qin K, et al. A novel tissue-based liver-kidney-on-a-chip can mimic liver tropism of extracellular vesicles derived from breast cancer cells. Biotechnol J, 2020, 15(2): e1900107.

[25] Lin N, Zhou X, Geng X, et al. Repeated dose multi-drug testing using a microfluidic chip-based coculture of human liver and kidney proximal tubules equivalents. Sci Rep, 2020, 10(1):8879.

[26] March S, Ramanan V, Trehan K, et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nat Protoc, 2015, 10(12):2027-2053.

[27] Ma B, Zhang G, Qin J, et al. Characterization of drug metabolites and cytotoxicity assay simultaneously using an integrated microf luidic device. Lab Chip, 2009, 9(2):232-238.

[28] Prot JM, Bunescu A, Elena-Herrmann B, et al. Predictive toxicology using systemic biology and liver microfluidic "on chip" approaches: application to acetaminophen injury. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 259(3):270-280.

[29] Schwartz RE, Fleming HE, Khetani SR, et al. Pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells. Biotechnol Adv, 2014, 32(2):504- 513.

[30] Ma C, Zhao L, Zhou EM, et al. On-chip construction of liver lobule-like microtissue and its application for adverse drug reactionassay. Anal Chem, 2016, 88(3):1719-1727.

[31] Vernetti LA, Senutovitch N, Boltz R, et al. A human liver microphysiology platform for investigating physiology, drug safety, and disease models. Exp Biol Med (Maywood), 2016, 241(1): 101-114.

[32] Ortega-Prieto AM, Skelton JK, Cherry C, et al. "Liver-on-a-chip" cultures of primary hepatocytes and kupffer cells for hepatitis B virus infection. J Vis Exp, 2019, (144):e58333.

[33] Kang YB, Sodunke TR, Lamontagne J, et al. Liver sinusoid on a chip:Long-term layered co-culture of primary rat hepatocytes and endothelial cells in microfluidic platforms. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(12):2571-2582.

[34] Deng J, Chen Z, Zhang X, et al. A liver-chip-based alcoholic liver disease model featuring multi-non-parenchymal cells. Biomed Microdevices, 2019, 21(3):57.

[35] Gröger M, Dinger J, Kiehntopf M, et al. Preservation of cell structure, metabolism, and biotransformation activity of liver-on-chip organ models by hypothermic storage. Adv Healthc Mater, 2018, 7(2).

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.009

“重大新药创制”国家科技重大专项（2018ZX09201017-001）

100176 北京，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室

周晓冰，Email：zhxb@nifdc.org.cn

2021-12-02