骨肉瘤干细胞差异表达microRNA对其干性特性的影响

王芊，张博文，罗鹏，郭建勋，王宏刚，聂井君，王任先，陈大福

·论著·

骨肉瘤干细胞差异表达microRNA对其干性特性的影响

王芊，张博文，罗鹏，郭建勋，王宏刚，聂井君，王任先，陈大福

探讨骨肉瘤干细胞差异表达 microRNA（miRNA）及其对骨肉瘤干细胞的干性特性（自我更新、侵袭、凋亡）的影响。采用无血清悬浮培养法和流式分选术分离鉴定骨肉瘤干细胞；分别采用成球实验、体外侵袭鉴定骨肉瘤干细胞的干性特性；高通量测序检测骨肉瘤干细胞中差异表达 miRNA；采用定量逆转录 PCR（qRT-PCR）技术检测相关差异表达 miRNA 的情况，验证 miRNA 结果；相关 miRNA 抑制剂干扰后，分别进行成球实验和侵袭实验检测 miRNA 对骨肉瘤干细胞自我更新、侵袭能力和细胞凋亡的影响。成功分离 Saos-2 的 CD133+和 CD133-细胞，具有较强的自我更新能力和侵袭能力。与 CD133-细胞相比，CD133+细胞的高表达 miRNAs 共有 15 个；低表达 miRNAs 共有 2 个。采用 qPCR 技术验证高通量测序差异表达 miRNA 相关结果，CD133+亚群中 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表达上调，miR-3143、miR-3150a-5p表达下调。抑制相关高表达 miRNA（miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091）表达后，CD133+细胞的自我更新能力和侵袭均下降，细胞凋亡上升。骨肉瘤干细胞中具有多种差异表达 miRNA，其对骨肉瘤干细胞的干性特性具有调控作用。

骨肉瘤干细胞； CD133； 自我更新； 侵袭

骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤，好发于青少年，骨肉瘤具有明显的转移特性。一旦发生转移，则预后很差，其 5 年平均的生存率为 20% ～ 30%[1-2]。目前对于影响骨肉瘤侵袭和转移的分子机制尚不明确。因此，降低骨肉瘤复发转移的发生，探究复发转移发生发展的机制非常重要。

骨肉瘤干细胞（osteosarcoma stem cells，OSCs）是指骨肉瘤中存在一少部分具有干细胞性质的细胞群。2005 年，Gibbs 等[3]首次报道了一小部分具有自我更新能力，并能在无血清悬浮培养条件下形成肿瘤细胞球的细胞，这部分细胞高表达 STAT3 和多潜能干细胞标记 Oct3/4、Nanog，显示出干细胞样的特性[4-6]。国内外研究者通过侧群细胞法、无血清悬浮培养、表面标志物分选等多种途径成功分离了 OSCs。此外，OSCs 表面标志物被发现，如CD133、CD117、CD271、Stro-1 等[7-9]，这些表面标志物对于骨肉瘤干细胞的分离鉴定至关重要。骨肉瘤干细胞表型功能和分子机制的不断深入研究，为骨肉瘤的靶向治疗提供了新策略。

microRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的非编码单链 RAN 分子（平均长度 22 个核苷酸），参与转录后基因表达调控[10-11]。大量研究表明，miRNA 在多种 OSCs 中表达异常，对 OSCs 的自我更新、侵袭迁移、耐药等特性具有重要的调控作用[12-13]。本研究重点探讨骨肉瘤 CD133+细胞亚群差异表达的 miRNA，并进一步研究这些 miRNA 对骨肉瘤 CD133+细胞亚群生物学特性的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 骨肉瘤细胞系 Saos-2 购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库；B27、bFGF、EGF、Mccoy's 5A 和 FBS 均购自美国 Gibco 公司；抗人 PE-CD133 抗体购自德国美天旎公司；miRNA isolation kit 购自美国 Ambion 公司；miRNA 抑制剂购自 Ribobio 公司；Matrigel 购自美国 Corning 公司；lipofectamine 3000 购自美国 Invitrogen 公司。

1.1.2 仪器 CO2细胞培养箱和流式细胞仪均为美国 Thermo 公司产品；倒置相差显微镜为日本 Olympus 公司产品；ABI7500 荧光定量 PCR 为美国 Applied Biosystems 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 骨肉瘤细胞的成球培养 采用含 10% 胎牛血清的 Mccoy's 5A 培养基，在 37 ℃、5% CO2的条件下培养，将对数生长期的 Saos-2 细胞用胰酶消化至单个细胞，制备成细胞密度为 2 × 104/ml 的细胞悬液，接种于含 B27（1:50）、bFGF（20 ng/ml）和 EGF（20 ng/ml）的 DMFM/F12 无血清培养基中，Saos-2 经无血清悬浮培养 11 d 可形成紧实的细胞球体，在光学显微镜下计数。

1.2.2 流式细胞术分析及分选 Saos-2 的 CD133+细胞 消化对数期的 Saos-2 单细胞悬液，1200 r/min离心5 min 后用 PBS 洗 1 遍，加入 PE-CD133 以 1:50 比例稀释抗体细胞，重悬细胞浓度至 1 × 107/ml，37 ℃避光孵育 30 min，PBS 洗 2 遍，用 PBS 重悬，上机行流式细胞仪分析及分选。

1.2.3 miRNA 芯片和生物信息学分析 miRNA 芯片采用 illumina Xten 测序平台。提取分选后的 Saos-2 的 CD133+和 CD133-细胞RNA。提取后的 RNA 经标记后与芯片杂交。利用 seqtk（1.0-r82-dirty）对预处理数据进行质量控制分析，新 miRNA 预测使用 miRdeep2（2.0.0.5）软件，靶基因检索使用 miRanda（v3.3a）软件，靶基因查询及预测使用 R 软件包 multimiR。

1.2.4 qRT-PCR 实验 采用 miRNA isolation kit 提取流式分选后所得的 Saos-2 中CD133+和CD133-细胞的 miRNA，收集细胞 2 × 106个，lysis/binding buffer 振荡以破解细胞释放 miRNA，涡旋后在冰上放置 10 min，9000 ×离心洗脱1 min；加入 100 μl 无 RNA 酶水，盖紧后最大速度离心 20 ～ 30 s。利用 Bulge-Loop miRNA qRT-PCR primer set 和 qRT-PCR starter kit，预变性 95 ℃10 min，变性 95 ℃ 2 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 10 s，40 个循环，以 U6 基因作为对照。

1.2.5 miRNA 抑制 使用不含抗生素的无血清培养基稀释分选得到 CD133+和CD133-细胞，以 1 × 105个/孔接种于六孔板中，过夜培养。miRNA 抑制剂的终浓度为 60 nmol/L，采用 lipofectamine 3000 将 miRNA 抑制剂和阴性对照转染至细胞中。转染后 4 h，加入无血清培养基。72 h 后，收获细胞进行相应实验。

1.2.6 体外自我更新能力的分析 取分选得到细胞或者 miRNA 抑制剂处理后的细胞，以500 个/孔的密度接种于低黏附 24 孔板，用无血清悬浮培养基培养，在 37 ℃、5% CO2孵箱中培养，11 d 后观察成球情况。

1.2.7 体外侵袭实验 取无血清培养基稀释后的 Matrigel（1 mg/ml）50 μl 平铺于 Transwell 小室的上室，放置 37 ℃培养箱 1 h。将分选得到细胞或者 miRNA 抑制剂处理后的细胞以 10 万/ml、200 μl/孔均匀加在 Matrigel 上，Transwell 小室的下室加入含 10% 血清的 Mccoy's 5A 完全培养基。48 h 后，割片、DAPI 封片。

1.2.8 细胞凋亡实验 将分选得到细胞或者 miRNA 抑制剂处理后的细胞调整浓度为 1 ×106个/ml，加入 Annexin V 5 μl，避光孵育 15 min，上机前加入 PI 5 μl，避光孵育 15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理

应用 SPSS13.0 软件统计分析，计数资料差异采用2检验，组间差异采用检验，< 0.05 时表示有统计学差异。

2 结果

2.1 人骨肉瘤细胞系 Saos-2 的 CD133+细胞的分离

采用无血清悬浮培养和表面标志物流式细胞分选术，检测并分选 Saos-2 细胞中CD133+、CD133-细胞亚群。图 1 可知分选 Saos-2 细胞中 CD133+的比例为 2.1%。

2.2 人骨肉瘤细胞系Saos-2 的CD133+细胞生物学特性的研究

2.2.1 自我更新能力的分析 无血清培养的成球实验结果表明，在骨肉瘤细胞系 Saos-2 中 CD133+细胞亚群成球数明显高于 CD133-细胞亚群，分别为 34.67 ± 5.033、10.33 ± 2.517（< 0.001），差异具有统计学意义（图 2）。因此，Saos-2 的 CD133+细胞亚群具有较强的自我更新能力。

2.2.2 侵袭能力的分析 体外侵袭实验表明，在Saos-2 中CD133+细胞亚群侵袭细胞数明显高于CD133-细胞亚群，几乎是 CD133-细胞亚群侵袭细胞数的 2 倍，该差异具有统计学意义（= 0.001）（图 3）。因此，人骨肉瘤 Saos-2 的 CD133+细胞亚群具有较强的侵袭能力。

图1 流式细胞术检测并分选 Saos-2 细胞中 CD133+、CD133-细胞亚群

Figure 1 CD133 expression analysis in Saos-2 cells was detected by FACS

图2 Saos-2中CD133+和CD133-细胞亚群自我更新能力的比较（*P < 0.001）（A：统计图；B：镜下观察）

Figure 2 Comparison of the self-renewal ability in CD133+and CD133-cells from Saos-2 (*< 0.001) (A: Statistical graph; B: Microscopic observation)

图3 Saos-2 细胞中CD133+和CD133-亚群侵袭能力的比较（*P < 0.001）（A：统计图；B：镜下观察）

Figure 3 Comparison of the invasion capacity in CD133+and CD133-cells of Saos-2 cells (*< 0.001) (A: Statistical graph; B: Microscopic observation)

2.3 OSCs 差异表达 miRNA 及其验证

中科普瑞公司采用 illumina Xten 测序平台对样本进行高通量测序，对分选后的 Saos-2 中 CD133+和 CD133-细胞亚群进行分析。结果表明：上调 miRNA 共有 15 个，下调 miRNA 共有 2 个。结合文献调研、相关 miRNA 研究现况及相关信号通路，采用 qPCR 技术对差异表达miRNA 表达进行验证。与 CD133-细胞亚群相比，CD133+亚群中 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表达上调（相应值均为 < 0.0001），miR-3143、miR-3150a-5p 表达下调（相应值均为 < 0.0001），与高通量 miRNA 测序表达结果相符（图 4）。

2.4 miRNA 对 OSCs 生物学特性的调控作用

2.4.1 对 OSCs 自我更新能力的影响 基于高通量 miRNA 测序表达结果，对上述上调 miRNA 相关功能进行研究。Saos-2 的 CD133+细胞中，对照组成球数为 40.6 ± 3.1，干扰 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表达后，无血清培养的成球数分别为 22.3 ± 3.5、30.7 ± 2.1、32.7 ± 1.5、28.7 ± 2.1（相应值为 0.0024、0.0094、0.0154、0.0049），差异均具有统计学意义（图 5）。因此，抑制 miRNA 表达后，人骨肉瘤干细胞的自我更新能力均减弱。

图4 Saos-2 中 CD133+和 CD133-细胞亚群差异表达 miRNA 的验证

Figure 4 Verification of expressed miRNAs in CD133+and CD133-cells from Saos-2

图5 miRNA 对 Saos-2 细胞中 CD133+细胞自我更新能力的影响

Figure 5 The effect of miRNAs on the self-renewal capability of CD133+cells in Saos-2 cells

2.4.2 对 OSCs 侵袭能力的影响 Saos-2 的 CD133+细胞亚群中，对照组侵袭细胞数为 217.7 ± 9.6，干扰 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表达后侵袭细胞数分别为：139.3 ± 3.1、127.0 ± 7.6、173.3 ± 5.0、182 ± 6.0（相应值为 0.0002、0.0002、0.0021、0.0057）（图 6）。因此，抑制 miRNA 表达后，OSCs 的侵袭能力均减弱。

图6 miRNA 对 Saos-2 细胞 CD133+细胞侵袭能力的影响

Figure 6 The effect of miRNA on the invasive ability of CD133+cells in Saos-2 cells

图7 miRNA 对 Saos-2 细胞 CD133+细胞凋亡的影响

Figure 7 The effect of miRNA on the apoptosis of CD133+cells in Saos-2 cells

2.4.3 对 OSCs 细胞凋亡的影响 Saos-2 的 CD133+细胞亚群中，通过Annexin-V/PI 染色联合流式细胞术检测相关亚群的凋亡情况，对照组细胞凋亡率为（2.58 ± 0.38）%，干扰 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表达后细胞凋亡率分别为：（7.14 ± 0.43）%、（7.91 ± 0.13）%、（5.75 ± 0.40）%、（4.76 ± 0.24）%（相应值为 0.0002、< 0.0001、0.0006、0.0011）（图 7）。因此，抑制 miRNA 表达后，OSCs 的凋亡能力均增强。

3 讨论

骨肉瘤是原发性肿瘤中最常见、恶性程度最高、发病率最高的恶性骨肿瘤，如何提高治疗的有效率，减少骨肉瘤的复发和转移，是目前临床中对骨肉瘤治疗的研究重点。根据肿瘤干细胞的理论，OSCs 具有自我更新、强致瘤性、多向分化潜能、产生异质性肿瘤细胞的生物学特征，目前研究普遍认为 OSCs 是恶性骨肉瘤容易转移和复发的根源。

近年来，已有很多报道关于 OSCs 的分选方法，如软甲基纤维素分选、侧群细胞分选、流式分选、免疫磁珠分选、无血清培养分选等。上述分选方法可以依据 OSCs 的性质和表面标志进行分类，而大量的文献报道的可作为肿瘤干细胞标志的分子很多，其中 CD133 是一种跨膜糖蛋白，发现于大多数肿瘤干细胞，现作为广谱的标记物被应用于肿瘤干细胞的分辨与分离。实验研究证实在多个骨肉瘤细胞系中 CD133+细胞表现出干细胞特性，确定CD133 为筛选骨肉瘤中肿瘤干细胞的关键性标识。本研究通过无血清悬浮培养和 OSC 标志物 CD133 流式分选技术相结合成功分离 OSCs。体外功能实验也证明分离得到的CD133+细胞具有典型的肿瘤干细胞生物学特性：较强的自我更新能力、侵袭和耐药能力。

目前的研究证实 miRNA 在多种肿瘤干细胞中表达异常，通过调节癌或抑癌基因对肿瘤干细胞及肿瘤发病机制发挥重要作用[14]。Mei 等[15]研究表明 miR-33b-3p 通过靶向 DOCK4 来抑制前列腺癌的转移，从而为前列腺癌的治疗带来新希望。Hadavi 等[16]在乳腺癌中发现 miR-3143 可显著抑制 PIK3CA、AKT1 及相应的 mRNA 的表达，对术后诊断具有重要的参考意义。本研究中，对骨肉瘤细胞系 Saos-2 中 CD133+与 CD133-细胞亚群进行高通量测序 miRNA 表达差异比较，以表达相差 2 倍以上作为标准区分。结果表明：上调 miRNA 共有 5 个，下调 miRNA共有 2 个。结合文献调研和相关miRNA 研究现况，我们重点分析了上调表达的 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091和下调表达的 miR-3143、miR-3150a-5p。采用 qPCR 技术对相关miRNA 表达情况进行验证，结果证明与 miRNA 表达谱的结果相符合。体外功能实验结果表明：上述上调表达的 miRNA 在骨肉瘤干细胞的自我更新、侵袭和细胞凋亡等生物学特性上具有调控作用。miR-33b-3p 对自我更新能力影响最大；miR-3648 对侵袭和凋亡影响最大。因此，骨肉瘤干细胞中具有多种差异表达的miRNA，对骨肉瘤干细胞生物学特性具有调控作用。

综上所述，miRNA 在 OSCs 的自我更新、增殖、分化及侵袭等方面起到重要作用。利用 RNA 干扰（RNAi）对异常表达的 miRNA 进行调控，从而间接调控 OSCs 生物特性，以期对骨肉瘤进行干预。因此，探寻常规骨肉瘤细胞和 OSCs 的 miRNA 表达的差异，抑或发现骨肉瘤发生发展时期特异表达的 miRNA，都将促进骨肉瘤诊断与治疗的新策略。

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The aberrant expression of microRNA and its influence on biological characteristics of osteosarcoma stem cells

WANG Qian,ZHANG Bo-wen, LUO Peng, GUO Jian-xun, WANG Hong-gang, NIE Jing-jun, WANG Ren-xian, CHEN Da-fu

We aim to investigate the aberrant expression of microRNA (miRNA) in osteosarcoma stem cells (OSCs) and their effects on biological characteristics of OSCs.The serum-free suspension culture and flow cytometry sorting technology were used to isolate human OSCs. Biological characteristics of OSCs were evaluated by sphere colony formation assay, invasion assay and apoptosis assay. miRNA microarray was performed to analyze differentially expressed miRNA in OSCs. Quantitative RT-PCR was used to validate the microarray data of selected miRNA. The effect of miRNA inhibitors on biological characteristics of OSCs were examined.CD133+and CD133-cells from Saos-2 cell line were successfully isolated. Functional studies revealed that CD133+cells from Saos-2 cell line had the characteristics of cancer stem-like cell, which formed more sphere colonies, showed higher invasiveness than CD133-cells. Compared with CD133-cells, 15 highly expressed miRNA and 2 lowly expressed miRNA were identified by miRNA array in CD133+cells. qRT-PCR analysis validated that miR-33b-3p, miR-3648, miR-4442, miR-5091 were up-regulated, and miR-3143 and miR-3150a-5p were down-regulated in CD133+cells from Saos-2 cell line. Inhibition of the up-regulated miRNA (miR-33b-3p, miR-3648, miR-4442, miR-5091) could suppress the self-renewal capacity, invasion ability and enhance apoptosis in CD133+cells from Saos-2 cell line.Several differentially expressed miRNA in human OSCs could regulate biological characteristics of OSCs.

osteosarcoma stem cells; CD133; self-renewal capacity; invasion

Laboratory of Bone Tissue Engineering, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China

CHEN Da-fu, Email: chendafujst@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.004

国家自然科学基金面上项目（51973021、52173275）；北京市属医学科研院所公益发展改革试点项目（第四批：京医研2021-6）

100035北京市创伤骨科研究所骨组织工程研究室/北京积水潭医院

陈大福，Email：chendafujst@126.com

2021-12-27