基于网络药理学探讨大青叶治疗病毒性呼吸道感染作用机制及物质基础

王法琴，金莹莹

(南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300)

大青叶IsatidisFolium是十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥叶[1]，其化学成分包括生物碱类、有机酸类、苷类、微量元素等。大青叶具有清热解毒、凉血消斑之效[2]。能够发挥抗肿瘤、解热、抗炎、提高免疫力、抗内毒素、抗病原微生物等作用[3]，在临床上有广泛应用。

呼吸道感染RTI(Respiratory tract infection)是呼吸道因病原微生物入侵并繁殖而造成的感染。按感染部位，可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。老年人、婴幼儿、免疫功能低下、慢性呼吸道疾病患者易感染此病，尤其是兼患严重慢性肺部疾病者，可因严重并发症而预后不良。

近年来，人们对大青叶有效成分及药理活性的研究日益深入，但对于大青叶生物碱抗病毒、治疗呼吸道感染作用机制方面的研究还很少。网络药理学基于中药复方多成分、多靶标、多途径的整体调控机体模式，整合多个数据库信息，从分子网络水平探索大青叶治疗呼吸道感染的作用机制[4]。本研究基于网络药理学，以大青叶中所含生物碱为对象进行研究，筛选生物碱成分，对其潜在作用靶点和呼吸道感染相关的疾病靶点进行整理、筛选，进行蛋白质相互作用的分析、基因本体(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析，并构建“成分-靶点-通路”网络图，从整体揭示大青叶对RTI的干预作用及其机制，为后续深入研究大青叶中不同活性成分调节RTI的作用机制的研究提供依据。

中药总生物碱的含量测定常用酸性染料比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气质联用法等。酸性染料比色法属于离子对萃取比色法，结合紫外分光光度法，对总生物碱含量进行测定。本实验采用此法采取酸性染料比色法测定大青叶中总生物碱的含量，利用四因素三水平L9(34)正交设计，设定缓冲液pH、缓冲液用量、指示剂(酸性染料)用量、有机溶剂萃取的用量为影响因素，比较各提取条件下的吸光度值，确定含量测定的最优条件。

1 材料与方法

1.1 生物碱成分靶点和疾病靶点的筛选

成分靶点筛选：通过中药系统药理数据库(TCMSP)检索大青叶的化学成分。在TCMSP数据库中去除无靶点化合物，筛选生物碱类活性成分，获取生物碱成分的Related targets及Target name信息，输入至String数据库，选择以Homo sapiens为Organism的条件，转化为靶点相应的Gene Symbol，得到各生物碱成分的作用靶点。

疾病靶点筛选：运用GencardS，OMIM，Drugbank三个数据库进行筛选。均以“Respiratory tract infection(呼吸道感染RTI)”为搜索词，检索并去重获得疾病靶点。

1.2 构建药物-疾病交集靶基因蛋白互作网络

为了明确大青叶生物碱成分与呼吸道感染疾病靶点之间的对应关系，利用韦恩图Venny筛选成分靶点蛋白与疾病靶点蛋白的交集，将所获得的交集靶点的数据信息输入String数据库，进行PPI蛋白相互作用分析，物种设定为“Homo Sapiens”，去除游离的靶点，构建PPI网络图。

向绘图软件Cytoscape 3.7.2中导入PPI网络图的TSV文件。分析网络，计算节点的属性值，根据Degree值调节各个节点的大小和颜色。

1.3 基因本体(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析

将“1.2”项下的交集靶点以Excel形式导入Hiplot 平台，运用GO/KEGG富集分析插件(v 0.1.4)进行KEGG和GO分析。选择上传KEGG数据库和相应的Org DB，进行GO细胞组分(Cell component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)、生物学过程(Biological process，BP)以及KEGG通路富集分析，输出富集柱状图和气泡图。

1.4 构建大青叶“成分-靶点-通路”网络图

将大青叶生物碱成分、作用靶点与作用通路富集分析结果进行整理，导入 Cytoscape 3.7.2软件，构建“成分-靶点-通路”网络图，以探究大青叶治疗呼吸道感染的药效学作用机制。

1.5 酸性染料比色法测定大青叶总生物碱含量

酸性染料比色法是在一定 pH 值的溶液体系中，生物碱与H+结合成阳离子，酸性染料与其结合成有色离子对，经有机溶剂如氯仿、乙酸乙酯萃取后，定量溶解于有机溶剂，在紫外可见分光光度计中测定有机层的吸光度，可代入标准曲线即可计算得出生物碱含量[5]。

1.5.1 仪器、材料与试剂 大青叶药材(安徽省丰厚铜陵中药饮片有限公司，批号 20100823)；E-201-C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；KH-500B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；ME104E电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；UV-1800PC 紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；R-3 HB旋蒸仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；HH-S2数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

溴甲酚绿(国药集团化学试剂有限公司，批号：20201023)；氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180403)；二氯甲烷(上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20150707)；盐酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180628)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180419)；无水乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20210111)；冰醋酸(上海申博化工有限公司)。

1.5.2 大青叶总生物碱的提取 以二氯甲烷为溶剂，利用相似相溶原理，使亲脂性生物碱溶于亲脂性有机溶剂。旋蒸并回收溶剂，蒸干后得大青叶总生物碱。取大青叶粉末100 g，加3倍量的2.5%氨水浸泡12 h，8倍量的二氯甲烷按5∶3∶2比例回流提取3次，每次1 h，旋蒸仪减压回收溶剂至近干，蒸干即得。

1.5.3 对照品溶液的制备 由于大青叶生物碱的结构与3-吲哚甲醛结构相似，因此选3-吲哚甲醛作为对照品。精密称取3-吲哚甲醛对照品10 mg于试管中，加入1%盐酸乙醇溶液10 mL，超声溶解，作为对照品溶液(每1 mL 含3-吲哚甲醛1 mg)。

1.5.4 供试品溶液的制备 称取“1.5.2”项下大青叶总生物碱样品2.5 mg于试管中，加入1 mL 1%盐酸乙醇溶液，超声溶解，即得供试品溶液。

1.5.5 酸性染料的制备[6]称取溴甲酚绿200 mg，加0.05 mol/L NaOH 3.5 mL研磨使其溶解，加水至200 mL，即得溴甲酚绿指示液。

1.5.6 检测波长的选择 向2个分液漏斗中分别加入1 mL对照品溶液、1 mL供试品溶液，各加入5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液和5 mL溴甲酚绿指示液，混匀，用5 mL二氯甲烷萃取。进行萃取液的紫外全波长扫描，二者的最大吸收峰都在414 nm处，所以检测波长设定为414 nm。

1.5.7 标准曲线制备 精密吸取“1.5.2”中的对照品溶液0.32、0.48、0.64、0.80、0.96、1.12、1.28、1.44、1.60 mL于不同试管中，加入1%盐酸乙醇溶液至1 mL。各加入5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液和2 mL溴甲酚绿指示液，混匀，用5 mL二氯甲烷萃取。于紫外414 nm处测量吸光度。以对照品溶液的浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.8 大青叶总生物碱的含量测定 “1.5.2”项下提取出的大青叶总生物碱，按照标准曲线的测定方法测定供试品溶液中总生物碱的含量。

1.6 正交试验选择最优含量测定条件

平行称取大青叶样品9份，每份2.5 mg，均置于小试管中，各加入1 mL 1%盐酸乙醇溶液，超声溶解，即得供试品溶液。

分别精密吸取供试品溶液各1 mL于分液漏斗中，加入5 mL醋酸—醋酸钠缓冲液和5 mL溴甲酚绿指示液，混匀，用5 mL二氯甲烷萃取。将1 mL 1%盐酸乙醇经同样操作，所得萃取液作空白置零并进行紫外全波长扫描。二者的最大吸收峰都在414 nm处，所以检测波长设定为414 nm。

利用L9(34)正交设计(表1)[7]，通过四因素三水平，考察影响含量测定相关因素，影响因素设定为缓冲液pH、缓冲液用量、指示剂(酸性染料)用量、有机溶剂萃取用量。于414 nm处测定9份样品的吸光度值并进行比较，选择最优的含量测定条件。含量测定的因素水平见表1。

表1 总生物碱含量测定因素水平

2 结果

2.1 生物碱成分靶点和疾病靶点的筛选结果

通过TCMSP数据库的检索，去除无靶点的化合物，最终共检索到6个生物碱类化合物，获取生物碱成分的Related targets及Target name信息，转化为靶点的Gene Symbol，去重后最终得到39个靶点。6种成分中，靶点最多的是靛玉红，涉及27个靶点；其次是靛蓝和色胺酮。生物碱成分及其靶点基因的具体信息见表2。

表2 生物碱成分及其靶点基因

疾病靶点筛选：运用GenCards，OMIM，Drugbank三个数据库进行筛选。均以“Respiratory tract infection(呼吸道感染RTI)”为搜索词，检索疾病靶点。运用Excel整理三个数据库得到的疾病靶点并去重，最终得到9 410个疾病靶点。

2.2 构建药物-疾病交集靶基因蛋白互作网络

利用韦恩图Venny筛选成分靶点蛋白与疾病靶点蛋白的交集，得到38个交集靶点，分别为PPARG，CYP1A1，AHR，NOS2，PTGS1，PTGS2，ESR1，AR，RXRA，CDK2，GABRA1，MAPK14，GSK3B，HSP90AA1，CHEK1，CCNA2，CHRM1，CHRM3，PDE3A，SCN5A，CA2，ACHE，ADRB2，PRSS1，IFNG，CCL5，NQO2，DRD1，HTR3A，HGF，ABCB1，NCOA2，SLC6A3，SLC6A4，KDR，MAOB，LYZ，CDKN3(图1)。

图1 靶点交集韦恩图

将结果输入String数据库，对交集靶点进行PPI蛋白相互作用分析，物种设定为“Homo Sapiens”，去除游离的靶点，剩余35个相互作用的节点，构建PPI网络图。

下载PPI网络图的TSV文件，导入至Cytoscape 3.7.2。分析网络，计算节点的属性值，根据Degree值调节各个节点的大小和颜色，PPI网络中节点越大、颜色越亮表示节点的关联性越大，排名前5的为PTGS2、ESR1、HSP90AA1、AR、PPARG。根据节点相互作用强度调节连接线的粗细，相互作用越强，线条越粗(图2)。

图2 String 交集靶点PPI网络

2.3 基因本体(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析结果

运用GO/KEGG富集分析插件(v 0.1.4)进行GO、KEGG分析。

GO分子功能(Molecular function，MF)、生物学过程(Biological process，BP)、细胞组分(Cell component，CC)以及KEGG通路富集分析，得到富集柱状图和气泡图(图3)。

GO-BP分析筛选保留前10条富集结果，主要涉及离子转运的正向调节、活性氧代谢过程、肽基丝氨酸磷酸化、跨膜转运的正向调节等；GO-MF分析筛选保留前10条富集结果，涉及核受体活性、RNA聚合酶II通用转录起始因子结合、配体激活的转录因子活性等；GO-CC富集到10条结果，涉及谷氨酸能突触、突触前膜、突触后膜等。KEGG结果富集到10条结果，涉及IL-17 信号通路、钙信号通路、Th17 分化细胞、血清素能突触、PI3K-Akt通路、小细胞肺癌等信号通路，主要与病毒感染、炎症反应、机体免疫、细胞生长分化和创伤愈合等相关[8]。各富集结果信息见表3。

图3 GO生物学分析和KEGG富集分析

2.4 构建大青叶“成分-靶点-通路”网络图

通过Cytoscape 3.7.2软件，根据大青叶的有效成分、靶点和作用通路，构建“成分-靶点-通路”网络图。该网络共有54个节点(包括6个生物碱活性成分、38个靶点、10条通路)。如图4所示，靛玉红、色胺酮、靛蓝等节点度值排名靠前，可能为大青叶中重要的生物碱成分。

2.5 酸性染料比色法测定大青叶中总生物碱含量

2.5.1 标准曲线 按“1.5.5”项下方法测定。以吲哚-3-甲醛浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。从而得到线性回归方程Y=0.480 8X+0.014 3，R2=0.998 7，表明3-吲哚甲醛在0.32～1.60 mg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系。

2.5.2 大青叶总生物碱含量测定 采用二氯甲烷提取大青叶总生物碱，在紫外414 nm处有最大吸收，吸光度为0.716 0，根据标准曲线计算得出：提取出的总生物碱含量为58.38%。大青叶总生物碱选用二氯甲烷提取，此方法提取的总生物碱杂质较少，易于进行后期的纯化。

2.5.3 含量测定正交试验方案[7]及结果 正交实验中的各实验均按照“1.6”项下方法。分别采用表1中设计的缓冲液pH、缓冲液用量、指示剂(酸性染料)用量、有机溶剂萃取用量，对9份样品进行萃取，于414 nm处测定并进行比较吸光度值，选择最优的含量测定条件。结果见表4。

2.5.4 正交试验结果分析 根据表4对试验的结果进行分析：酸性染料比色法测定大青叶总生物碱含量试验中RA>RD>RC>RB，表明影响大青叶总生物碱含量测定的因素主次顺序为A>D>C>B，即缓冲液pH是影响总生物碱含量测定的最主要因素，其次是有机溶剂用量，指示剂用量、缓冲液用量影响较小。

表3 富集分析结果

注：A为生物碱成分，B为作用靶点，C为作用通路。

图5 标准曲线

表4 含量测定正交试验方案及结果

运用酸性染料比色法测定大青叶总生物碱含量的最优条件为A1B3C3D3，即缓冲液pH=3.6、用量为6 mL，指示剂用量为4 mL，有机溶剂用量为6 mL。

3 讨论

大青叶具有抗肿瘤、解热、抗炎、提高免疫力、抗内毒素、抗病原微生物等作用，其所含有效成分可分为生物碱、有机酸、黄酮类、苯丙素等，其中生物碱是发挥作用的主要成分。吲哚类生物碱(靛蓝、靛玉红、菘蓝苷B、异靛蓝等)，具有抑制癌细胞增殖[9]、免疫调节[10]的作用，喹唑酮类生物碱(青黛酮、4(3H)喹唑酮、色胺酮等)具有一定的抗病毒活性。

本研究通过网络药理学方法，分析了大青叶生物碱治疗呼吸道感染的分子机制，预测PTGS2、ES-R1、HSP90AA1、AR、PPARG等可能是治疗呼吸道感染的重要靶点。靶点前列腺素内过氧化酶(PTGS2)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)对炎症、脂质代谢具有一定影响，PEG2的产生与PTGS2密切相关，它参与细胞运动、增殖和抗凋亡活动；生长因子、炎性细胞因子、肿瘤启动子诱导PTGS2合成，进一步合成PG产生炎症反应[11]。PPARG的活化可以促进脂肪细胞降低 TNF-α的释放[12]。ESR1主要通过刺激生长因子的表达，抑制相关炎性细胞因子如IL-1，6、TNF-α的分泌，保护细胞不被破坏[13]。因此，大青叶的生物碱成分可作用于相关靶点，减少炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的释放，从而减轻炎症反应。大青叶生物碱作用于HSP90AA1靶蛋白，通过对有机物的反应、细胞生物合成过程的正向调控，引起自噬抵御病毒感染，对治疗呼吸道感染具有重要作用[14]。

大青叶生物碱靶点之间相互作用，通过IL-17 信号通路、Th17 分化细胞、钙信号通路、PI3K-Akt等信号通路引起机体内部反应，从而参与呼吸道感染的发展过程。IL-17是Th17细胞分泌的促炎细胞因子，通过促进激活T细胞、刺激上皮、内皮、成纤维细胞产生如 IL-6、IL-8、GM-CSF、CAM-1[15]等多种细胞因子，促进 TNF-α、IL-1β 等细胞因子的表达[16]，从而导致炎症的产生。大青叶生物碱或可作用于钙通道或钙释放使Ca2+浓度升高，影响病毒的生命周期从而发挥防治病毒的作用[17]。生物碱可调控Th17分化细胞、IL-17信号通路，抑制炎症细胞因子的产生，从而抑制炎症反应，保护呼吸道组织。PI3K/Akt信号通路：细胞增殖、凋亡、转化与磷脂酞肌醇-3-激酶PI3K通路相关；Akt是位于PI3K下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Akt磷酸化后具有激酶活性，使下游分子发生磷酸化，从而调控细胞凋亡。生物碱通过调控PI3 K/Akt信号通路，促使炎症细胞凋亡[18]，减少相关炎症因子的分泌[19]，抑制炎症反应。

大青叶生物碱可作用于一些抗病毒、抗炎、免疫调节信号通路，抑制炎症细胞因子的产生，抑制炎症反应，从而对呼吸道感染产生治疗作用。但本研究仅限于网络药理学层面，还需通过进一步的探索和验证，对具体的调控机制、关键靶点进行深入研究。

酸性染料溴甲酚氯主要用于吲哚类、喹唑酮类生物碱的含量测定，也可用于萜类、甾类、有机胺类、异喹啉类或混合型生物碱的含量测定。在适当的pH体系中，溴甲酚氯可与阳离子生物碱形成离子对，经二氯甲烷萃取后溶于有机相中，可通过紫外分光光度计测定大青叶总生物碱含量。

缓冲液的pH是影响测定结果的一个重要因素。当缓冲液的pH适当时，生物碱全部生成阳离子，同时，酸性染料生成足量的阴离子，二者结合生成定量的离子对络合物，从而充分溶解于有机溶剂中。pH过低或过高，均会影响离子对的稳定性，从而影响测定结果。而缓冲液的用量则关系着整个体系的pH。试验中使用的有机溶剂为二氯甲烷。如果有机溶剂萃取用量不足、次数不够，离子对将不能被萃取完全，则会导致总生物碱测定出的含量小于其实际含量。