基于恶露不尽模型大鼠的秀山地区特色炮制技术“十三制”香附炮制增效作用研究

陈明容，支世君，商思阳，贾 琳，吴文辉

(重庆市中医院，重庆 400021)

香附为莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根茎，始载于《名医别录》，列为中品，原名“莎草”[1]。香附之名来源于《唐本草》，称“莎草根香附子”[2]，原因是其根相附连续而生，可以制香料，故名。古人称其为“气病之总司，女科之主帅”，广泛用于气郁所致的疼痛，尤善治疗妇科病症和月经不调。香附在历史上的炮制方法有近50种之多，复制法是其特色，据现有文献记载可从二制一直延续到九制，可见其临床地位。本研究课题组通过前期对重庆市中药炮制技术传承进行普查时发现，在秀山地区有一种“十三制”法尚未有古籍记载，是当地苗族和土家族独具特色的炮制技术，历史上曾广泛用于渝东南部各区县，主治妇女产后气滞血瘀、恶露不尽。在进一步对其炮制工艺和炮制原理进行分析后发现，“十三制”香附采用了四个步骤十四种辅料共奏其理气、化瘀、止血之功。但是，亦由于其炮制繁琐，辅料众多，不适应现代化工业生产而逐渐退出临床，故其临床疗效如何需要进一步的研究和论证[3]。因此，本研究采用现代中医证候模型方法，以恶露不尽(功能性子宫出血或子宫迁延性出血)雌性大鼠为模型，对比研究炮制前后的增效作用，为特色中药炮制技术传承提供思路和方法。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SD大鼠，雌性性成熟未生育，雄性性成熟，体质量230～250 g，SPF级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。

1.2 实验仪器

HYC-310S医用冷藏箱(海尔)；Synergy HTX全波段酶标仪(Bio-teck)；超低温冰箱(Thermo)；TGL-18C-C台式离心机(上海安亭)；RT-3100C全自动洗板机(雷杜生命科技有限公司)；AXLM1820-2超纯水机(阿修罗)；UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)。

1.3 实验材料

香附原药材购买于重庆桐君阁股份有限公司，经重庆市中医研究院中药制剂研究所副所长杨敏主任中药师鉴定为莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根茎；小茴香、艾叶、泽兰、香薷、益智、莱菔子均符合《中国药典》(2020年版)一部性状要求；宫血宁胶囊(云南白药集团股份有限公司，0.13 g*18粒/盒，批号：ZH12005)；米非司酮片(上海新华联制药有限公司，25 mg*6片/盒，批号：C019200602)；米索前列醇片(上海新华联制药有限公司，0.2 mg*3片/盒，批号：C024201001)；大鼠绒毛膜促性腺激素(CG)、大鼠雌二醇(E2)和大鼠孕酮(P)均购于江苏晶美生物科技有限公司，批号：202012。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备

香附生品：取原药材，除去毛须及杂质，碾成绿豆大粒块，或润透，切薄片，干燥，筛去碎屑。

“十三制”香附：取原药材适量，将糯稻草灰与东墙土按 1∶10混合，用东流水将此二物调成稀泥状，煮沸，待冷。将毛香附投入其中，搅拌均匀，浸泡至翻泡。随即反复搅拌去毛，洗净泥土和鳞毛，低温烘至五成干。再用童便适量，浸泡过夜，洗净，低温烘至七成干。用小茴香、艾叶、泽兰、香薷、益智仁、莱菔子共煎汁，浓缩至适量，与童便浸香附共煮至干，低温烘至九成干。再按糖、姜、盐、醋四制法制后干透，即得成品。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 宫血宁阳性对照液制备 宫血宁胶囊去壳粉碎，临用时用0.5%羧甲基纤维素钠配置成80.21 mg/mL宫血宁混悬液(相当于成人日服剂量10倍)[4-6]。

2.2.2 供试品溶液制备 将香附生品和“十三制”香附粉碎为粗粉，75%乙醇回流提取2次，每次10倍量，每次提取1 h，后药渣水回流提取2次，每次10倍量，每次提取1 h，合并4次提取液减压浓缩至无醇味，0.5%羧甲基纤维素钠分别配置成92.55 mg生药/mL (相当于成人日服9 g剂量)、2 776.50 mg生药/mL(相当于成人日服9 g剂量30倍)和5 553.00 mg生药/mL(相当于成人日服9 g剂量60倍)混悬液。

2.2.3 米非司酮与米索前列醇溶液制备 将米非司酮片与米索前列醇片分别粉碎成细粉，临用时用0.5%羧甲基纤维素钠分别配置成米非司酮1.66 mg/mL和米索前列醇20 μg/mL混悬液。

2.3 造模、分组及给药

2.3.1 造模 将雌性大鼠与雄性大鼠按雌-雄2∶1合笼，次日晨进行阴道涂片显微观察，以发现阴道栓子或游动精子为受孕成功大鼠，记为妊娠第 1天[7-9]。在妊娠第7天的早上和下午分别灌胃米非司酮(8.3 mg·kg-1)和米索前列醇(100 μg·kg-1)，建立大鼠恶露不尽模型(早孕不完全流产、功能性子宫出血或子宫迁延性出血)。

2.3.2 分组及给药 取受孕成功雌性大鼠90只，随机分为模型组、宫血宁阳性组、生品(低、中、高)剂量组、“十三制”(低、中、高)剂量组，以正常怀孕为正常妊娠组，每组10只。各组大鼠于造模后次日(妊娠第8天)，除空白组和模型组灌胃给予等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液外，给予相对应的药物，1次/d，给药剂量为1 mL/100 g，给药前禁食不禁水12 h，持续7 d。

2.3.3 恶露情况观察及血量采集和测定 各组大鼠于妊娠第7天(造模当天)，在上午给与米非司酮后，同时于阴道内置入定量棉球1个(棉球重 85 mg～100 mg，用塑料薄膜包裹半侧，以防血液漏出和尿液返流)，记录置入时间，并于下午给予米索前列醇后置换新的棉球，记录置换时间，后续每日分别于置入时间和置换时间将棉球取出，单独放入离心管中密闭冷藏保存，同时置换1个新棉球于阴道内，连续7 d。

最后一次给药结束2 h后，每只大鼠尾静脉取血20 μL，加入4 mL5%NaOH，混匀，待用。将收集的含有大鼠子宫血液棉球离心管，根据出血量的实际情况加适量5%NaOH，反复多次浸渍、挤压、搓洗棉球，至洗脱液无色为止，收集并记录洗脱液总量，以5%NaOH 溶液为空白对照，在546 nm 处分别测定浸提液以及大鼠静脉血的吸光度(A)，并按照以下公式计算恶露血量：

V1=稀释尾静脉血所用5%NaOH量(mL)；V2=浸提子宫血所用5%NaOH量(mL)。

2.3.4 血清采集及测定 末次给药2 h后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，离心，取血清，按试剂盒要求进行测定，或-80 ℃保存，备用。

2.4 结果

2.4.1 恶露情况 与正常妊娠组比较，模型组大鼠每日出血量和7 d总出血量均显著提高(P<0.01)，说明造模成功。给药干预后，相较于模型组，在每日出血量上，第1天均有少量出血，且各给药组出血量与模型组相差不大，无统计学差异(P>0.05)；第2-7天，“十三制”香附中剂量组在出血量最多的第2-4日可显著降低出血量(P<0.05)，但在第5-7日无统计学差异(P>0.05)，而“十三制”香附高剂量组在第2-7日的出血量中出血量均有显著降低(P<0.05)。在7 d总出血量上，“十三制”香附(低、中、高)均具有显著降低出量的作用(P<0.05)。其余各给药组除阳性组外，无统计学差异。见表1、表2。

表1 各组大鼠7 d恶露总血量

2.4.2 生殖激素水平 与正常妊娠组比较，药物流产后模型组大鼠血清绒毛膜促性腺激素(CG)、雌二醇(E2)和孕酮(P)水平值均显著降低(P<0.01)。给药干预后，相较于模型组，“十三制”香附在中剂量下雌二醇(E2)水平得到显著恢复(P<0.05)，“十三制”香附在高剂量下绒毛膜促性腺激素(CG)、雌二醇(E2)均得到显著恢复(P<0.05)。其余各给药组除阳性组外，无统计学差异。见表3。

3 结论

米非司酮和米索前列醇联合作用于模型早孕大鼠不完全流产模型可造成绒毛膜促性腺激素(CG)、雌二醇(E2)和孕酮(P)显著低于正常妊娠组。香附经过秀山地区特色炮制技术“十三制”法炮制后可显著降低恶露出血量，并恢复紊乱的雌激素(CG、E2、P)水平，说明“十三制”法确有炮制增效作用，可用于妇女产后恶露不尽。

4 讨论

传统中药炮制理论认为香附生用解表止痛、醋炒消积止痛、酒炒通络止痛、炒炭止血；而秀山地区特色“十三制”法通过糯稻灰、东墙土、童便、小茴香、艾叶、泽兰、香薷、益智、莱菔子、红糖、生姜、盐、醋等十数种辅料炮制的共同作用，亦表现出较强的止恶露作用，通过分析，其可能原因与辅料的作用、炮制的制法和服用方法有密切关系。其中，童便味咸，性寒，能滋阴降火、凉血散瘀，并有治疗阴虚火升引起的咳嗽、吐血、鼻出血及产后血晕之功效；艾叶汤浸，固冲任，止下痢，可用于妇人漏血；醋味酸、苦，性温，具引药入肝，理气、止血、行水、消肿、解毒、散瘀止痛等作用；而十三制香附的制法总体可认为是将其所用十数种辅料经过提取后，由香附作为主药和载体，将所有有效物质集于一身，并以散剂入药，此相当于用炮制的方法改变了处方药味繁多的临床应用形式，更接近于现代的中成药制备，其更多的炮制增效作用尚待进一步验证和深入研究。

表2 各组大鼠每日出血量动态观察

表3 各组大鼠生殖激素水平