尿液外泌体lncRNA PCAT-1评估非浸润性膀胱癌患者复发的价值

钱文晖，陈全兵，朱洪儒，陈 鹏，姜亚志，魏 勇,2

(1.南京市高淳人民医院泌尿外科，南京 211300；2.南京中医药大学附属医院泌尿外科，南京 210029)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，以50岁以上中老年人多见，据统计，膀胱癌的发病率在全身恶性肿瘤中约占3%左右，其中约70%为非肌层浸润性膀胱癌，复发率高达30%～80%[1]。手术切除治疗是临床上治疗非浸润性膀胱癌的主要治疗方法，但术后患者复发率较高，严重影响了患者的生活质量。统计发现，早期非浸润性膀胱癌患者的5年生存率超过95%，若出现肌层浸润患者的5年生存率明显降低[2]。但由于早期非浸润性膀胱癌患者的临床症状不明显，而膀胱镜检查对患者造成的损伤较大，因此，寻找一种安全、简便、可靠的生物学标志物来协助临床诊断、评价疾病严重程度及预后具有重要作用。随着分子生物学技术的发展，外泌体检测逐渐受到医学研究者们的关注。外泌体是一种存在于血液、尿液等多种体液中的一种脂质双层囊泡，能够运输蛋白质等物质从而介导细胞通信[3]。有学者证实肿瘤细胞释放的外泌体能够促使肿瘤微环境的形成，促进肿瘤的远处转移[4]。长链非编码RNA(Long non coding RNA,lncRNA)是一种不具有蛋白编码能力的非编码RNA，其能够通过多种不同的方式来调控基因的表达与蛋白的合成。有研究认为，lncRNA在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色[5]。据报道，外泌体中的RNA较体液总RNA稳定性更高[6]。本组研究中对非浸润性膀胱癌患者及健康受检者中尿液外泌体长链非编码RNA前列腺癌相关转录本1(Long non coding RNA prostate cancer related transcript 1,lncRNA PCAT-1)表达量进行对比，对其评估非浸润性膀胱癌患者复发的价值进行了相关探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2015年1月—2016年3月在南京市高淳人民医院进行治疗的非浸润性膀胱癌患者50例作为非浸润性膀胱癌组。入组标准:(1) 所有患者均确诊为膀胱癌且经病理学检查确诊患者为非肌层浸润性膀胱癌；(2) 患者及其家属同意进行此试验；(3) 为首次发病。排除标准:(1) 经手术或放化疗治疗；(2) 存在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；(3) 不能配合研究；(4) 参与研究前1周进行过膀胱镜检查。选取同时期在本院进行健康体检的健康受检者50例作为对照组。参与本研究的研究对象及其家属均知情同意并签订知情同意书，同时本研究经医院伦理委员会同意批准，均符合医学伦理学，伦理批准号为(同)2022-001-01。

1.2 主要仪器及试剂

透射电子显微镜(北京仪信网通科技有限公司，型号:JEM-ARM300F2)；-80 ℃超低温冰箱(北京爱立斯生物科技有限公司，型号:DW-86L626)；电子天平(上海精密仪器仪表有限公司，型号:JA2603)；低温高速离心机(长沙东旺实验仪器有限公司，型号:TG20KR-D)；实时荧光定量PCR测定仪(深圳市三莉科技有限公司，型号:TL988-IV)；异丙醇(武汉翔合亿化工科技有限公司)；无水乙醇(东莞市万信精细化工有限公司)。

1.3 观察指标

所有研究对象均留取晨起中段尿150 mL，于留取后2 h内进行处理。收集非浸润性膀胱癌患者的临床病理参数，包括性别、年龄、是否伴有淋巴结转移、病理分级(高级别、低级别)及病理分期(Ta、T1)。取非浸润性膀胱癌患者与健康受检者尿液并提取外泌体，采用实时荧光定量PCR法测定非浸润性膀胱癌组与对照组尿液外泌体中lncRNA PCAT-1表达情况。取待检尿液，离心，取上清液，加入Slurry B 1 200 μL，混匀，静置，离心，去除上清液，加入Lysis Buffer A 200 μL充分裂解外泌体，加入适量异丙醇充分混匀，在室温下静置离心，去除上清液，加入Wash Solution A 300 μL，1 500×g,离心20 min，去除上清液，重复步骤3次；使用分光光度计测定提取物RNA水平；使用反转录试剂盒合成cDNA，配制PCR反应体系，待反应完成后上机检测。采用2-ΔΔCt的方法计算lncRNA PCAT-1表达水平。分析尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与临床病理参数的相关性。

随访:自实验开始对实验对象进行紧密随访，随访形式包括门诊随访、电话随访等。随访截止时间为2021年3月，每次门诊随访均需行血清肿瘤标志物、MRI检查，如果怀疑肿瘤复发则可能需进一步行病理检查。

1.4 统计学处理

采用SPSS22.0软件包进行统计学数据分析。本组研究中计量资料两两比较釆用方差齐性检验。尿液外泌体lncRNA PCAT-1与尿液脱落细胞学对非浸润性膀胱癌的诊断价值采用ROC曲线分析。建立ROC曲线，分析尿液外泌体lncRNA PCAT-1与尿液脱落细胞学对非浸润性膀胱癌的诊断价值。建立ROC曲线，分析尿液外泌体lncRNA PCAT-1评估非浸润性膀胱癌复发的价值。影响非浸润性膀胱癌患者复发的相关因素采用Cox比例风险回归模型分析。尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与非浸润性膀胱癌患者预后的关系采用Kaplan-Meier生存曲线分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 非浸润性膀胱癌患者临床病理参数对比

50例非浸润性膀胱癌患者中以男性多见，病理分级及病理分期分别以高级别及T1期占比较高，而患者大多伴有淋巴结转移，见表1。

表1 非浸润性膀胱癌患者临床病理参数对比Tab.1 Clinicopathological parameters of 50 patients with non-invasive bladder cancer

2.2 两组尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达情况

非浸润性膀胱癌组患者尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达水平较对照组明显升高(5.76±2.23vs1.17±0.56,P<0.01),见图1。

图1 两组尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达情况Fig.1 Expression of lncRNA PCAT-1 in urine exosomes of the two groups

2.3 尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与临床病理参数的相关性

尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与性别、年龄、淋巴结转移、病理分级无相关性(P>0.05)，与病理分期具有明显相关性(P<0.01)，见表2。

表2 尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与临床病理参数的相关性Tab.2 Correlation of the expression of lncRNA PCAT-1 in urine exosomes and clinicopathological parameters of patients

2.4 尿液外泌体lncRNA PCAT-1与尿液脱落细胞学对非浸润性膀胱癌的诊断价值

建立ROC曲线，尿液外泌体lncRNA PCAT-1与尿液脱落细胞学的曲线下面积分别为0.833、0.620，敏感度分别为81.26%、24.52%，尿液外泌体lncRNA PCAT-1诊断非浸润性膀胱癌的曲线下面积明显高于尿液脱落细胞学，见表3、图2。

表3 尿液外泌体lncRNA PCAT-1与尿液脱落细胞学对非浸润性膀胱癌的诊断价值Tab.3 Diagnostic value of urinary exosomal lncRNA PCAT-1 and urine exfoliative cytology in non-invasive bladder cancer

图2 尿液外泌体lncRNA PCAT-1与尿液脱落细胞学对非浸润性膀胱癌的诊断价值Fig.2 ROC curve for urinary exosomal lncRNA PCAT-1 and urine exfoliative cytology in diagnosis of non-invasive bladder cancer

2.5 影响非浸润性膀胱癌患者复发的相关因素

采用Cox比例风险因素回归模型分析，病理分期及lncRNA PCAT-1均为影响非浸润性膀胱癌患者复发的独立危险因素，见表4、5。

表4 影响非浸润性膀胱癌患者复发单因素分析Tab.4 Univariate analysis of recurrence in patients with non-invasive bladder cancer

表5 影响非浸润性膀胱癌患者复发多因素分析Tab.5 Multivariate analysis of recurrence in patients with non-invasive bladder cancer

2.6 尿液外泌体lncRNA PCAT-1评估非浸润性膀胱癌患者复发的价值

建立ROC曲线，lncRNA PCAT-1与病理分期的曲线下面积分别为0.763、0.634，lncRNA PCAT-1评估非浸润性膀胱癌患者复发的价值更高，见表6、图3。

表6 尿液外泌体lncRNA PCAT-1评估非浸润性膀胱癌患者复发的价值Tab.6 Value of urinary exosomal lncRNA PCAT-1 in evaluating recurrence of non-invasive bladder cancer

图3 尿液外泌体lncRNA PCAT-1评估非浸润性膀胱癌患者复发的价值Fig.3 Urinary exosomal lncRNA PCAT-1 in assessment of recurrence in patients with non-invasive bladder cancer

2.7 尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与非浸润性膀胱癌患者预后的关系

以尿液外泌体lncRNA PCAT-1相对表达量均值作为截断值，将50例患者分为高表达组(23例，>5.14±1.04)与低表达组(27例，≤5.14±1.04)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，lncRNA PCAT-1低表达量组生存期明显高于lncRNA PCAT-1高表达组，见图4。

图4 尿液外泌体lncRNA PCAT-1表达与非浸润性膀胱癌患者预后的关系Fig.4 Relationship between urinary exosomal lncRNA PCAT-1 expression and prognosis of non-invasive bladder cancer

3 讨 论

膀胱癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，根据其是否侵入肌层分为非浸润性膀胱癌及浸润性膀胱癌，其中，非浸润性膀胱癌占膀胱癌的80%以上，具有多为点同时发生及复发率较高的特点。随着医疗科技的进步，人口老龄化趋势的发展，非浸润性膀胱癌的发病率正逐年升高。目前，临床上主要采用膀胱镜检查及尿脱落细胞学检测，但膀胱镜检查费用较高，对患者造成的损伤较大；而尿脱落细胞学检测特异度较低[7-8]。因此，寻找准确性及敏感度较高的的诊断方法对预防患者复发，提高患者治疗效果，改善患者预后意义重大。

外泌体是一种广泛存在于人体血液、尿液、唾液等多种体液中的双层囊泡小体，其形成与细胞关系密切[9]。细胞作为人体的基本结构，在其生长过程中会分泌多种细胞因子、生长因子、细胞外基质蛋白等，从而为肿瘤细胞的生长提供了有利条件[10]。研究发现，外泌体作为一种细胞外泌物，能够进入肿瘤细胞，并在肿瘤细胞间进行蛋白质的转运及信息的传递，外泌体可以作为一种重要的肿瘤标志物[11]。近年来，对非浸润性膀胱癌尿液外泌体内容物的研究发现，非浸润性膀胱癌尿液外泌体中包裹的生物物质，尤其是lncRNAs对非浸润性膀胱癌的诊断及预后评估具有重要意义[12]。lncRNAs是一种长链非编码RNA，大多数不具有蛋白质编码功能，其对细胞的增殖、分化及肿瘤的发展起着重要作用[13]。Zhang等[14]发现，外泌体lncRNAs在区分肿瘤细胞及正常细胞，反映肿瘤细胞的病理变化及病情程度方面扮演着重要角色。PCAT-1是近年来新发现的一个转录调节因子，首先在前列腺癌中被发现。Guo等[15]的研究显示，PCAT-1在非浸润性膀胱癌中的表达水平明显升高，且其表达水平与细胞的增殖、凋亡密切相关。

肿瘤的发生、发展是一个复杂的过程，本研究结果发现，非浸润性膀胱癌患者尿液外泌体中lncRNA PCAT-1的表达水平明显升高，且其表达量与非浸润性膀胱癌病理分期明显相关；此外，尿液外泌体lncRNA PCAT-1诊断非浸润性膀胱癌的曲线下面积明显高于尿液脱落细胞学，这表明尿液外泌体lncRNA PCAT-1可以作为早期诊断非浸润性膀胱癌的重要指标，其能够直接反映非浸润性膀胱癌的病理学状态。在本研究中，经Cox比例风险回归模型及Kaplan-Meier生存曲线分析发现，尿液外泌体lncRNA-PCAT-1是影响非浸润性膀胱癌复发的独立危险因素，且尿液外泌体lncRNA PCAT-1高表达与非浸润性膀胱癌患者的高复发率明显相关。尿液外泌体lncRNA PCAT-1可以作为诊断非浸润性膀胱癌患者复发的重要指标。

综上所述，外泌体lncRNA PCAT-1在非浸润性膀胱癌患者尿液中的表达水平较健康受检者明显升高，且其表达水平与患者病理分期明显相关。尿液外泌体lncRNA PCAT-1对评估非浸润性膀胱癌患者的复发具有重要作用。