神经内分泌前列腺癌生物标志物与治疗靶点研究进展

周 振，冯立明，姚旭东，叶 林,

(1.南京医科大学上海十院临床医学院泌尿外科，南京 211166；2.新疆沙湾市人民医院普外泌尿科，新疆 沙湾 832100；3.同济大学附属第十人民医院泌尿外科，上海 200072)

前列腺癌是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，位居美国男性发病率第1位、死亡率第2位[1]，近年我国前列腺癌发病率也持续上升。尽管几乎所有的转移性前列腺癌初期都对内分泌治疗敏感，然而经过12～18个月的治疗，患者都不可避免地发展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)，最终导致疾病的复发和进展[2]。

尽管近年来晚期前列腺癌的治疗手段发展迅速，但还有较多问题需要解决，且耐药性成为了目前的主要难题。前列腺癌的耐药机制多种多样，通常发生在激活的雄激素受体(androgen receptor,AR)信号转导的背景下。虽然AR是前列腺癌开始和进展的主要驱动因素，但部分前列腺癌类型初始相对独立于AR，甚至在疾病过程中始终不依赖于AR的调控。

神经内分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)多发生于长期ADT后，也称治疗诱导的NEPC，是一种预后极差的CRPC类型[3]。谱系可塑性和向小细胞NEPC的组织学转化是晚期前列腺癌治疗耐药性的机制之一，这也逐渐被学术界广泛认可。神经内分泌细胞在生理上分散于前列腺所有解剖区域的腺体上皮内。光镜下可见于分泌细胞之间的基底层含有多种肽激素，如嗜铬粒A(chromogranin A,CgA)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、血清素、组胺、降钙素、神经肽Y、血管活性肠肽、胃泌素、甲状旁腺激素相关蛋白等。近年来，研究已经确定了NEPC基因组、表观基因组和转录组的变化，将NEPC与常规前列腺腺癌区分，指出了其新的机制和治疗靶点。NEPC是在疾病进展过程中从前列腺腺癌中克隆产生的，早期基因组变异序列相似，并获得新的分子特征，所有这些导致肿瘤细胞脱离雄激素受体活性进行增殖，最终证明了从腔内前列腺癌表型到小细胞神经内分泌癌的谱系转换。识别最易受谱系可塑性影响的前列腺肿瘤亚群，制定有效的策略来早期检测NEPC患者并加以干预治疗，二者最终将大大改善前列腺癌患者的预后。鉴于临床上NEPC诊断与治疗的困难性，本文回顾了NEPC近些年新出现的治疗靶点，并讨论了可能对未来临床研究设计有帮助的生物标志物。

1 新兴的生物标志物

一些基于肿瘤组织和动物模型的研究已经确定了去势抵抗性前列腺腺癌和NEPC之间的基因组、转录组和表观遗传之间的差异[4]。虽然这些研究促进了机制研究和新靶点的验证，但在临床工作中获得转移性组织来进行广泛的分子检测是一个主要挑战。在评估NEPC时，活检通常是小范围的，并优先用于临床确诊(肿瘤形态、免疫组化)和靶向基因组分析，以便于确定目前已批准上市的药物治疗[如奥拉帕尼(Olaparib)、鲁卡帕尼(Rucaparib)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)]的靶点。经典神经内分泌标志物的免疫组化染色在临床上经常进行，并且可能与其他可以原位测量的NEPC相关标志物一起进行改进，如对RB1、DLL3、ASCL1、SWI/SNF复合物家族的免疫组化染色。在NEPC患者以及具有侵袭亚类型临床特征的患者中，经常检测到联合肿瘤抑制因子(RB1、TP53、PTEN)表达下降，这可能有助于确定患者是否需要更积极的系统性治疗方案，如铂类基础化疗[5]。这些肿瘤抑制基因缺失发生的时期以及其他互作基因组和表观基因组DNA改变在NEPC中的作用，尚未得到广泛的研究。

尽管越来越多的CRPC患者向NEPC进展，但已发表的文献中描述的样本总数仍然很低，而且在诊断标准、检测平台和所使用的分析方法等方面存在差异。针对原发肿瘤的评估表明，大多数NEPC特征通常不能早期发现，如细胞形态、RB1缺失、DNA甲基化的状态；但早期可能存在与AR独立性相关的转录组变化[6-7]。这些转录组变化是否预示了早期肿瘤微环境中NEPC的未来发展和/或治疗反应(如雄激素治疗和化疗疗效比较)尚未得到报道。鉴于大多数在NEPC中发现的靶向性改变可能是在治疗耐药性期间获得的，开发非侵入性生物标志物(如体液活检、分子成像)来检测与NEPC相关的分子变化是一个很有前景的方法。由于单一病灶转移性活检并不总是反映单个患者的病理异质性，因而非侵入性生物标志物能更准确地反映复合肿瘤负荷和肿瘤异质性。

1.1 游离DNA

在转移性前列腺癌等异质性疾病方面，浆细胞游离DNA(cell free DNA,cfDNA)研究在基因组和表观基因组水平上提供了有价值的参考。最近国外有团队分析了去势抵抗性前列腺腺癌和NEPC以及与之匹配的cfDNA[8]。他们通过全外显子和全基因组重亚硫酸盐测序发现：(1) cfDNA基因组学概述了关键驱动因素对NEPC的贡献(包括TP53、RB1和PTEN的缺失，MYC、MYCN和AR的扩增)；(2) 连 续取样可以跟踪某些亚克隆改变的发生；(3) 与NEPC相比，去势抵抗性前列腺腺癌患者的基因组异质性水平更高；(4) cfDNA的甲基化水平可以识别NEPC的特异性特征。此外，通过系列样本分析，他们发现在临床确诊NEPC之前，循环体液中可以检测到NEPC相关的DNA变化。并且他们发现针对不同患者以及不同转移部位，与NEPC相关的cfDNA改变通常是保守的，因此cfDNA的检测结果并不是由转移部位决定。目前有关cfDN检测的平台日趋成熟，这就给明确诊断NEPC创造了更多的机会。

虽然cfDNA测序提供了基因组负荷、突变负荷、特定体细胞DNA存在和DNA甲基化状态的信息，但对转录谱和关键靶点表达的非侵入性评估更具挑战性。Ulz等[9]提出了一种通过cfDNA评估转录因子活性的方法。具体来说，通过cfDNA全基因组测序和核小体足迹分析，并根据DNA片段模式推断转录因子可及性。研究显示AR、REST、HOXB13、NKX3-1和GRHL2结合位点的可及性差异能够区分NEPC和前列腺腺癌。将这种新方法与cfDNA甲基化、cfDNA的CHIP-seq或其他技术相结合，将为NEPC的表观遗传图景提供更全面的解读，并有能力跟踪治疗期间的动态和功能变化。

1.2 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)不仅可以检测肿瘤负荷，也可以通过mRNA或蛋白分析检测NEPC和腺癌细胞之间的形态学差异，以及其他药物靶点和耐药机制。利用Epic CTC平台，Beltran等[10]发现，与去势抵抗性前列腺腺癌患者相比，NEPC患者CTCs中更常见的是低或不表达AR、低细胞角蛋白表达，并具有较小的形态和细胞簇。在接受AR靶向治疗的CRPC患者中，CTCs异质性与不良预后相关[11]。最近国外的一项多中心前瞻性研究对107名未接受阿比特龙或恩杂鲁胺治疗的NEPC患者进行CTC评估[12]，发现其中8.7%的CTCs具有由细胞形态和大小确定的NEPC特征，它们的存在以及染色体不稳定均与患者不良预后相关。除了提供预后价值，CTCs还能够检测其他肿瘤特征，如AR-V7、SLFN11和DLL3的表达[13]。

1.3 细胞外囊泡

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)包括微囊泡和外泌体，其可以在CRPC患者的循环体液中检测到，包括那些CTC阴性但可能携带可被定量和连续跟踪的肿瘤相关蛋白的患者[14]。EVs作为NEPC检测谱系可塑性的生物标志物具有广泛的研究前景[15]。最新的研究结果表明，EVs具有重新编码细胞的能力，它们可能在驱动谱系可塑性方面发挥作用。例如，来自表达整合素αVβ3的前列腺癌细胞的EVs能够刺激肿瘤生长，并在肿瘤模型中驱动肿瘤神经内分泌分化[16]。

近年来，外泌体作为新兴的非侵入性检查标志物逐渐走进了大众视野，有关其研究得到了越来越广泛地关注，但是对于NRPC的探索仍旧十分有限。Lin等[17]发现，外泌体中的脂肪细胞分化相关蛋白可以促进前列腺癌向神经内分泌表型分化。δ-Catenin是β-Catenin超家族中的一种黏附结合蛋白，有研究报道在NEPC患者尿液来源的外泌体中δ-Catenin含量显著升高[18]。δ-Catenin可以促进Caveolin-1在前列腺癌来源的外泌体中聚集，而Caveolin-1可以通过NF-κB信号通路促进前列腺向神经内分泌表型的转化，这或许提示δ-Catenin对NEPC具有重要作用。

1.4 分子成像

分子成像是CRPC另一个新兴的非侵入性生物标志物。最近的研究集中于通过正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(PET-CT)成像来检测肿瘤中前列腺特异性膜抗原(PSMA)的表达，以及通过放射性核素靶向治疗(如Lu-PSMA-617)[19]。有一部分CRPC在疾病后期表达PSMA水平较低或PSMA表达缺失，也可通过PSMA PET-CT和同时用氟脱氧葡萄糖(fludeoxyglucose,FDG)PET-CT确诊的代谢依赖性病变检测到[20]。PET成像上PSMA阴性或PSMA/FDG不一致与侵袭性疾病和不良预后相关。当肿瘤失去AR表达时(如在NEPC中所见)，PSMA表达也可能失去。PSMA/FDG成像是否可以用于改善NEPC的检测是一个十分有价值的研究领域。使用Ga-68-DOTATOC PET/CT通过检测生长抑素受体表达来研究NEPC的结果各不相同，与胃肠道或肺的高分化神经内分泌肿瘤相比，NEPC中生长抑素的总体表达较低[21]。

2 靶点与治疗方式的选择

2.1 化疗

NEPC和小细胞肺癌在临床、病理和分子生物学方面较为相似，因此被证实为NEPC或者具有侵袭性变异特征的CRPC(AVPC)患者通常采用小细胞肺癌的治疗方案[22]。在国外，对于具有侵袭性变异特征或不利基因组学变异(PTEN、TP53和RB1中至少两个功能缺失)的患者，卡铂联合紫杉醇化疗目前得到了NCCN指南的支持。

2.1.1 紫杉烷+铂类药物 在mCRPC患者中，多西他赛是一种标准的治疗方式[23]。在Ⅱ期试验中，多西他赛对小细胞肺癌也显示出适度的活性，并被认为适合用于联合方案的评估。由于以铂为基础的化疗在神经内分泌分化的CRPC亚群中具有一定的活性，因此与多西他赛联合使用是改善NEPC患者群体疗效的合理尝试。

Culine等[24]对41例血清NSE和/或CgA升高的mCRPC患者进行了Ⅱ期研究，研究对象为顺铂联合多西他赛。几乎一半的患者有前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)反应(即PSA下降≥50%)，12例(41%)有客观部分反应。中位OS为12个月。联合治疗的安全性较差，91%的患者出现3～4级中性粒细胞减少，1例患者死于败血症。

为了提高安全性，Aparicio等[25]研究了卡铂/多西他赛联合应用于120例临床AVPC的mCRPC患者，随后采用依托泊苷/顺铂的挽救疗法。给与4个周期的卡铂/多西他赛后，47%的患者在第二个疗程中达到了PSA反应，34%的患者达到了可测量疾病的客观反应。卡铂/多西他赛组的中位无进展生存期为5.1个月，中位OS为16个月。毒性总体上是相当可控的，最常见的3级事件是感染(n=8)和发热性中性粒细胞减少(n=3)。4级事件包括血栓形成(n=2)和血小板减少(n=1)。1例毒性相关死亡(依托泊苷/顺铂治疗期间败血症)。

基于这些结果，Corn等[26]在存在AVPC(每组约55%)的mCRPC患者中进行了卡巴他赛vs卡巴他赛联合卡铂的Ⅱ期随机试验。以铂为基础的联合治疗显示出了更好的疗效，特别是在AVPC亚组。更具体地说，联合组的中位无进展生存期比单纯卡巴他赛组得到改善(7.3个月vs4.5个月)。对AVPC分子特征的影响进行后续分析，发现RB1、Tp53和/或PTEN的两个或多个改变。

2.1.2 依托泊苷+铂类药物 为了提高传统顺铂/依托泊苷方案对前列腺癌的疗效，Papandreou等[27]在一项Ⅱ期临床试验中研究了顺铂/依托泊苷和阿霉素联合治疗38例NEPC患者。结果显示，三联用药的获益-风险比被认为是不利的，因此不建议临床应用中在顺铂/依托泊苷的基础上增加阿霉素。

卡铂被认为是一种可接受的顺铂替代品，在mCRPC中作为单药具有中等活性。在mCRPC患者的Ⅱ期试验中，其被证实可与依托泊苷联合作为多西他赛后的二线治疗，且该组合的耐受性相当好[28]。但是，卡铂/依托泊苷用血清CgA和/或NSE升高的CRPC患者[29]，结果显示客观缓解率为9%，4名患者(7%)出现发热性中性粒细胞减少症，1名患者毒性相关死亡。因此这种组合的收益风险比并不理想。值得注意的是，这两项研究当中的卡铂/依托泊苷使用剂量和应用方式各不相同，这些不同可能造成了二者研究结果的差异。

2.2 靶向治疗

随着精确医学的兴起，胚系和体细胞检测常被强烈推荐用于高风险的局部晚期和转移性前列腺癌患者。尽管与NEPC有关的通路研究很多，但是已证实存在与治疗相关的选择却十分有限。由于相关的预后和治疗影响，检测DNA损伤修复(DNA damagerepair,DDR)基因缺陷包括同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)基因突变和错配修复(mismatch repair,MMR)基因突变以及由此产生的微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)应当包含在内。阳性结果可用于指导治疗决策，且这些结果可能与总体预后较差、替代治疗选择有限的NEPC患者特别相关。

2.2.1 免疫治疗 导致表型MSI和/或MMR缺陷的MMR基因突变包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的体细胞生长系改变，并可能与Lynch综合征有关。根据现有数据，3%～5%的前列腺癌患者存在MSI高/中或MMR不足的改变，<1%有Lynch综合征。了解这些分子改变的存在至关重要，因为它们可能是免疫检查点抑制剂如帕博利珠单抗(pembrolizumab)的靶点。帕博利珠单抗是一种抗程序化细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)抗体，该抗体于2017年被批准作为MSI高/MMR缺陷晚期实体肿瘤的二线疗法或后续一线治疗方法。2020年，美国FDA批准帕博利珠单抗可用于治疗高肿瘤突变负荷的肿瘤。目前，有关帕博利珠单抗在治疗晚期/转移性NEPC的Ⅱ期临床试验正在开展。

在AVPC患者中，MSI高/MMR缺陷肿瘤的确切发病率以及随后帕博利珠单抗适应证在NEPC中的临床相关性还有待了解。在NEPC患者中，尽管Aggarwal等[30]报道MMR基因MLH1、MSH2、MLH3和MSH6的体细胞突变几乎完全是相互排斥的(在8个患者中有7个)，但其他人报告了相反的结果。此外，文献中也报道了一些NE组织学分化和MSI/MMR缺乏的个例患者[31]。值得注意的是，随着时间的推移和基因组改变的出现，微卫星状态可能会改变为MSI。总之，应鼓励对AVPC患者进行MSI/MMR缺陷检测，并且应根据需要在这些患者中提供帕博利珠单抗作为二线或后线治疗。

无论MSI/MMR状态如何，一项随机、双盲Ⅲ期研究显示，在标准化疗(卡铂/依托泊苷)基础上加入抗PDL1抗体阿特珠单抗(atezolizumab)治疗的小细胞肺癌患者可获得良好的效益。这一结果表明患有其他神经内分泌分化的肿瘤患者(如NEPC)，也可能从检查点抑制中获益。为了回答这个问题，后续或许可以进行关于单独使用检查点抑制剂或联合使用药物治疗NEPC患者的研究。

2.2.2 DNA损伤反应通路 转移性前列腺癌患者在DDR基因中表现出相对较高的种系突变率,这些突变包括BRCA2、ATM、CHEK2、BRCA1、RAD51D和PALB2的改变(按频率降序排列)[30]。DDR基因的体细胞突变存在于23%的晚期mCRPC中，最常见的突变基因是BRCA2，占12.7%[32]。由于DDR尤其是BRCA2突变的前列腺肿瘤对聚(ADP-核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂有反应，所以了解患者的生殖系和体细胞DDR状态十分重要。目前两种药物(奥拉帕尼、鲁卡帕利)已在mCRPC中批准使用。NEPC中DDR改变的普遍性是有争议的，因为它们与Aggarwal等[30]的系列研究中的小细胞组织学几乎完全相互排斥，而其他人报告了相互矛盾的结果。此外，无论DDR状态如何，铂类化疗都被认为是小细胞前列腺癌的标准一线治疗选择。总之，在这一点上，DDR突变作为NEPC治疗靶点的相关性仍然有待研究。

2.2.3 Notch信号通路 Notch信号通路中的DLL3蛋白过表达与NEPC的侵袭相关。Rovalpi-tuzumabtesirine(Rova-T)是一种针对DLL3的靶向药物，现有Ⅱ期临床试验证实其在小细胞肺癌当中有着适度的临床活性，但疗效并不十分理想[33]。

2.3 靶向放射性核素疗法

靶向放射性核素治疗(targeted radionuclide therapy,TRNT)的特点是全身给与药放射性药物标记，从而靶向肿瘤细胞上表达的特定分子改变。带有α或β的放射性核素标记的小分子可将辐射直接传送到肿瘤部位。使用标有正电子或发射γ的放射性核素的相同药物，通过预处理成像来可视化目标的全身生物分布，完成了治疗诊断的概念。基于生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR)的TRNT，亦称为肽受体放射性核素疗法(peptide receptor radionuclide therapy,PRRT)，是治疗神经内分泌肿瘤的重要治疗方式。

现有的研究表明，肿瘤细胞表面的SSTR过表达，通过使用68GA-DOTA偶联的奥曲肽(octreotide)激动剂(如68GA-DOTA-TATE)进行PET/CT成像得到最佳证明和定量，是确定特定患者PRRT适宜性的基本要求[34]。这些治疗在胃肠胰等部位的神经内分泌分化肿瘤当中得到较好的验证。国外两项Ⅱ期临床试验已证实177Lu-PSMA-617在mCRPC中的应用价值，并表明其可能是mCRPC中卡巴他赛的潜在替代品[35]。可惜的是，目前暂无有关TRNT在NEPC中的报道。但是，在法国正在开展一项有关TRNT在甲状腺癌、神经内分泌性前列腺癌治疗价值的前瞻性临床研究，并有希望得出一些对临床诊疗有指导意义的结果。

3 展 望

NEPC是前列腺癌的一种侵袭性变异，是晚期前列腺癌耐药的重要原因。铂类化疗药物(如卡铂联合卡巴他赛)已得到NCCN指南的认可，但二线及以后的治疗措施是目前面临的主要临床挑战。虽然NEPC在最初诊断时可能存在某些分子特征，并且这些特征可能有助于未来谱系可塑性或AR独立性的发展，但大多数NEPC的改变是后来发生的。基因组突变(如RB1、TP53丢失)促进了NEPC的可塑性，且NEPC具有明显的表观遗传变化。针对NEPC中出现的关键基因/通路的试验需要对入组患者进行仔细地选择。转移性活检具有侵袭性，甚至在个别患者中也存在病理异质性，因而将非侵入性生物标志物(液体活检、分子成像)检测NEPC的分子特征纳入前列腺癌的临床研究是必要的。