阴道微生态与高危型HPV阳性子宫颈鳞状上皮内病变的相关性及临床预测模型建立

郭 灵，孙潇潇，2，成佳景,3

(1.南京医科大学，南京 211166；2.同济大学附属第十人民医院妇产科，上海 200072；3.同济大学附属上海市第四人民医院妇产科，上海 200081)

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，目前已明确了高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)持续感染是引起宫颈癌及子宫颈鳞状上皮内病变(squamous intraepithelial lesion,SIL)的病因，其中，HPV16及HPV18具有强致癌性[1]。但HPV阳性的患者中，约90%可通过自身免疫自然清除，仅少部分人会发生持续感染，进而发展为可检出的SIL甚至子宫颈癌[2-3]，这一过程通常需要数年[4]，提示宫颈病变的发展除了高危型HPV感染外还有其他协同因素。随着微生态组学的发展，阴道微生态作为女性特有的微生态系统也开始受到广泛关注。健康的阴道微生态有参与人体物质代谢、形成黏膜屏障、调控免疫等重要功能，而失衡的阴道微生态如阴道菌群异常、阴道pH值异常、过氧化氢缺乏等，可导致阴道对病原体的抵御能力下降，易继发生殖道感染性疾病[5-6]。许多研究认为，SIL的发生发展与子宫颈所处局部阴道微生态环境改变有关[7-8]。SIL是高危型HPV持续感染进展到子宫颈癌的中间阶段，如在此阶段使疾病得到逆转，将大大改善SIL患者的结局。本研究分析某些类型的阴道微生态变化，探究其与高危型HPV感染、不同级别SIL之间的关联，探讨这些阴道微生态检测指标是否能作为SIL发生发展的生物标志以区分可能消退和具有癌变潜能的病变，并进一步研究改善阴道微生态环境等对SIL的诊疗和预防的临床意义，从而帮助更有效预防、治疗宫颈疾病及拟定风险评估方案。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2019年4月—2021年4月于同济大学附属第十人民医院妇科就诊的高危型HPV(HPV16、18等)阳性且子宫颈液基薄层细胞学检测(thin prep cytologic test，TCT)结果≤高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)的患者，对HPV16/18型阳性患者及HPV other型阳性且TCT≥意义不明的非典型鳞状细胞(atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US)的患者做阴道微生态检测后行阴道镜检查、宫颈组织活检，或根据阴道镜活检结果进一步行LEEP术以明确宫颈病理结果。排除急性子宫颈炎、盆腔炎患者；1周内口服抗生素者；3 d内有性生活/阴道冲洗者；处于妊娠期、哺乳期者；免疫抑制性疾病或使用糖皮质激素者；子宫切除史、宫颈癌个人史或合并其他恶性肿瘤史者。最终收集患者757例，年龄18～68岁，根据宫颈组织的病理结果将患者分为子宫颈鳞状上皮内病变组(SIL组)347例和宫颈组织病理良性改变组(对照组)410例。

1.2 样本采集方法

受检者安躺于妇科检查台上，取膀胱截石位，将无菌阴道窥器以无菌石蜡棉球润滑后置入受检者阴道内，充分露出宫颈部，用阴道微生态检测专用无菌棉拭子采集阴道分泌物，自阴道上1/3侧壁处旋转棉拭子10～20 s，以能清晰看到分泌物附着为准，将其放入专用无菌检测试管中，常温干燥保存，并在取材后30 min内送至检验科由专业检验医师进行检测。之后，将HPV联合TCT检测的标本采样器毛刷的刷面插入子宫颈管内1 cm左右，顺时针旋转标本采样毛刷5圈，待刷取足量子宫颈上皮细胞后，将标本采样器刷头放入装有液基细胞保存试剂的专用无菌采样瓶中。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 HPV、子宫颈液基细胞学检测及判断标准 使用罗氏HPV检测平台进行样本检测并导出结果，结果分为HPV16型、18型、other型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)阳性。采用液基分离并滤掉标本中的黏液、血液、炎症组织，全自动Tripath染色、制片。由专业病理医师根据TBS(The Bethesda system)系统进行细胞学判读。

1.3.2 子宫颈组织病理学诊断方法及诊断标准 依据阴道镜操作规范采用光电一体阴道镜对HPV16/18型阳性或HPV other型阳性且TCT≥ASC-US的患者进行宫颈组织活检。必要时，按照LEEP刀标准操作流程对患者进行LEEP术。宫颈组织标本送病理科，由专业病理医师阅片，根据组织细胞异型性的程度和范围参考WHO的诊断标准及分类进行组织学诊断。

1.3.3 阴道微生态检测 本研究中的阴道微生态检测为临床检测方法，由专业检验科医师按照阴道微生态检测系统操作规程进行。

(1) 形态学检测：阴道分泌物涂片，干燥、固定后行革兰染色，在10倍目镜×100倍油镜下观察阴道菌群密集度、菌群多样性、优势菌(革兰阳性杆菌大多为乳杆菌，革兰阳性球菌多为链球菌，以及革兰阴性短杆菌如加德纳菌，革兰阴性短杆菌如普雷沃菌、动弯杆菌)，病原微生物(真菌、滴虫)，Nugent评分。

(2) 功能学检测：使用山东仕达思生物产业有限公司的阴道微生态检测仪Unit-500对检测阴道分泌物pH值，H2O2浓度，白细胞酯酶、唾液酸苷酶活性。

正常阴道微生态的定义为：阴道菌群的密集度为Ⅱ～Ⅲ级、多样性为Ⅱ～Ⅲ级、优势菌为乳杆菌、未见病原微生物、阴道pH值为3.8～4.5、乳杆菌功能正常(H2O2浓度正常)、唾液酸苷酶、白细胞酯酶等阴性。若其中任何1项发生异常，即诊断为阴道微生态失调[9]。

1.4 统计学处理

采用IBM SPSS 26.0和StataSE 15.0统计软件分析数据及作图。计数资料用频率百分比(%)表示，组间比较用χ2检验。进行多因素Logistic回归分析建立诊断临床预测模型，采用向后LR法筛选预测因子并计算其比值比(OR)与95%CI，并制作列线图(nomogram)。通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)、ho-smer-lemeshow(HL)和临床决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)分别评估模型的区分度、校准度和临床实用度价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 相关临床因素及阴道微生态检测结果比较

本研究共纳入患者757例，其中对照组410例，SIL组347例。两组相关临床因素比较显示，患者不同孕次及高危型HPV阳性情况差异有统计学意义(P<0.05)，而年龄、产次差异无统计学意义(P>0.05)。两组阴道微生态检测结果比较显示，菌群多样性、H2O2、细菌性阴道病(bacterial vaginitis,BV)差异有统计学意义(P<0.05)，而菌群密集度、优势菌、pH值、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)、滴虫阴道炎(trichomonas vaginitis,TV)差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 患者相关临床因素及阴道微生态检测结果比较Tab.1 Comparison of clinical factors and vaginal microecology test results of patients [n(%)]

2.2 危险因素的筛选及多因素Logistic回归临床预测模型的建立

将相关临床因素及阴道微生态检测结果纳入多因素Logistic回归分析，采用向后LR法筛选预测因子，结果提示与HPV other型阳性相比，HPV16/18单一型阳性、HPV16/18+other混合型阳性均是SIL发生的危险因素(P<0.05)，此外，菌群多样性增加、BV感染均是SIL发生的危险因素，而正常H2O2浓度是SIL发生的保护因素，见表2。上述筛选出的预测因子对SIL预测的相对重要性由Wald卡方值减去预测因子自由度(χ2-df)反映[10]，可见HPV分型是最主要的危险因素，其次是BV感染，见图1。根据该模型的预测因子构建列线图，见图2。

图2 基于4个预测因子建立的临床预测模型列线图Fig.2 Nomogram of clinical prediction model based on four predictors

表2 多因素Logistic回归分析结果Tab.2 Results of multivariate Logistic regression analysis

图1 预测因子在模型中的相对重要性Fig.1 Related importance of the predictors in the model

2.3 临床预测模型的验证

2.3.1 模型的预测性能评估 经过ROC分析，预测概率曲线下面积 (area under the curve,AUC)为0.677(95%CI：0.632～0.723)，表明该诊断临床预测模型对HPV阳性的子宫颈鳞状上皮内病变患者和宫颈组织病理良性改变患者之间的区分能力较好，见图3。HL检验P>0.05，表明此模型的拟合优度较高，校准曲线均为斜率接近于1的直线，表明SIL实际发生率和预测概率之间有很好的相关性，见图4。

图3 临床预测模型的ROC曲线及AUCFig.3 ROC curve and AUC of clinical prediction model

图4 临床预测模型的校准度曲线Fig.4 Calibration curve of clinical prediction model

2.3.2 模型的临床决策曲线分析 应用临床决策曲线分析评价该模型的临床实用度，当使用该模型的预测率为0.65以下时，采取治疗措施有净获益，见图5。

图5 临床预测模型的决策曲线分析Fig.5 Decision curve analysis of clinical prediction model

3 讨 论

宫颈癌的发生率、死亡率都居于妇科恶性肿瘤的第4位[11]。大量研究表明，SIL及宫颈癌与高危型HPV持续感染、多个性伴侣、多产等因素密切相关[12]，可见恶性肿瘤的发生是一个多步骤、多因素参与调控的复杂生物学过程。晚期宫颈癌主要依靠手术和/或放化疗等治疗方法，预后较差[12-13]。而SIL是HPV持续感染进展到子宫颈癌的中间阶段，其自然病程在很大程度上是不可预测的，目前的组织病理学检查无法区分哪些病变可以消退，哪些可能继续进展甚至发生癌变。在本研究中，SIL组患者与对照组相比，孕次较多、HPV16型及HPV18型阳性率高，差异具有统计学意义。舒慧敏等[14]发现上海地区宫颈病变患者的HPV阳性分型多为HPV16、18、33、52、31型，检出率总和高达90%，且HPV16、18与子宫颈病变严重程度显著相关，这一结果与本研究结果相似，提示有性生活的女性定期行HPV筛查，并对HPV16型及HPV18型感染的患者更进一步行宫颈检查对早期发现宫颈病变的重要性。大部分发生HPV感染的女性可通过自身免疫自然清除，仅少数患者会发生HPV持续感染，并进一步发生宫颈病变[15]，导致这些现象的原因也是目前研究的热点。有研究认为阴道微生态失衡通过直接和间接的机制，导致包括炎症状态、阴道黏膜上皮屏障破坏、代谢失调等，增加HPV持续感染风险，参与子宫颈病变的发生发展[16-17]，但对于此类研究结果目前尚存争议，其具体机制也有待于进一步研究。

正常阴道pH值为3.5～4.5，呈弱酸状态，阴道微生态以低度菌群多样性为特点，乳酸杆菌为其中的优势菌群。阴道乳酸杆菌通过竞争性黏附在阴道黏膜上形成抵抗致病性感染的屏障，激活补体系统和局部免疫反应，提供广谱保护，H2O2是乳酸杆菌分解的代谢产物，代表阴道内乳酸杆菌是否发挥正常功能抑制其他细菌的增长，其在阴道内的含量反映乳酸杆菌功能，具有控制病原微生物生长及抗病毒的作用[18]；而当阴道内乳酸杆菌减少，非乳酸杆菌多样性增加并占优势时，阴道pH值升高，H2O2含量降低，这种阴道微生态环境往往与阴道疾病状态相关[19-20]。Clarke等[21]发现阴道pH值升高会导致HPV感染风险增加。Brotman等[22]及Mitra等[23]的团队都证明了宫颈病变的持续存在或升高与阴道菌群多样性增加及乳酸杆菌的减少有关，对以乳酸杆菌为阴道优势菌群的患者来说，其宫颈病变更易消退。近年来，细菌预成酶谱(唾液酸苷酶、白细胞酯酶等)检测技术也已在阴道微生态评价体系中得到广泛应用。白细胞酯酶是白细胞破裂时释放的炎性反应的指标，标志阴道黏膜受损或炎性反应，通常认为阴道黏膜受损的情况下病毒更易侵袭宿主细胞[24]，Li等[25]发现白细胞酯酶异常可增加HPV16型阳性患者发生SIL的风险。目前已有很多研究证实了BV与HPV感染之间具有相关性，但BV与SIL之间是否存在相关性仍不明确。Usyk等[26]认为阴道内存在加德纳菌是持续性高危型HPV感染及宫颈病变进展的相关风险因素。Di Paola等[27]的研究显示阴道微生态菌群中含有与BV相关的厌氧菌群的患者，其高危HPV感染的持续时间较长，发生宫颈病变的风险更高。一些BV相关致病菌可产生蛋白毒素，诱导阴道上皮细胞溶解并对上皮细胞的免疫功能产生影响[28]，BV相关菌群通过激活免疫信号通路，产生细胞溶解素，可破坏阴道黏膜、降解阴道保护性黏蛋白[29-30]，此外，BV相关的厌氧菌可释放具有致癌性的胺类化学物质，而亚硝胺长期在局部积蓄可使子宫颈上皮细胞发生细胞转化[31]。

考虑到宫颈癌患者的阴道微生态检测结果可能受到恶性肿瘤的坏死组织及渗出物继发的阴道病原菌感染影响[32]，且此前已有较多针对阴道微生态与宫颈癌的相关研究，但对阴道微生态与SIL关系的文献报道较少[33]，因此本研究着重于阴道微生态与SIL的相关性。本研究通过组间比较发现，高危型HPV阳性SIL组患者的阴道微生态与对照组患者相比，菌群多样性增加，BV感染率升高，阴道内H2O2减少提示了宫颈病变患者阴道乳酸杆菌功能可能受到影响，这些观察指标的差异均有统计学意义，但两组之间的pH值、优势菌未见明显差异，后续可能需要进一步扩大样本量探究其是否可作为宫颈病变的预警指标。本结论与既往研究发现基本相符，提示在以上因素的影响下，各种病原体及HPV病毒更易黏附、侵袭发育不良的转化区鳞状上皮使宫颈对HPV的易感性增加，进而发生病变。

本研究通过Logistic回归分析相关临床因素及阴道微生态检测指标，使用向后LR法获得HPV阳性情况、菌群多样性、BV、H2O2作为预测因子，且这些指标在既往研究中作为危险因素是被广泛认可的。并以此制作列线图实现对疾病发生风险的图形展示及个体化预测，患者可根据列线图对每个预测因子亚组的赋值计算得到的总分计算结局事件的发生概率。建立模型后，通过ROC曲线、校准曲线、临床决策曲线分析三个层面对模型进行了验证，结果显示该模型的AUC为0.677(>0.7)，表明该模型对于疾病发生率的判别能力较强；校准曲线图也显示预测风险与实际风险具有较好的一致性；决策曲线分析可以评估基于该模型的决策是否能提高患者的预后，该方法建立在阈值概率的基础上，以观察临床适用性并平衡净效益。需要指出的是，该模型中未包括的因素并不表明其与SIL无关。本研究也存在一定的局限性：首先本研究为回顾性分析，存在一定程度的选择偏差；其次为单中心研究，虽然内部验证试验表明本研究所建立的预测模型是可靠的，但仍有待于进一步的外部验证。

综上所述，本研究认为，高危型HPV感染，尤其是16、18型HPV感染与SIL密切相关，而从HPV感染到发生SIL，该过程也受包括多孕、阴道微生态失衡如阴道菌群多样性增加、乳酸杆菌功能下降、合并BV感染等多种因素的影响。本研究采用Logistic回归分析筛选SIL发生的预测因子，建立诊断临床预测模型并从多角度对其进行验证。该模型有利于临床对高危型HPV患者的客观性评估及观察随访，并提示对于此类患者，改善阴道微环境，应用阴道乳酸杆菌制剂等用以补充阴道内功能下降的乳酸杆菌；合并BV感染者，积极治疗BV等方式，或可成为宫颈病变防治的辅助策略。