顶空气相色谱法测定美罗培南的残留溶剂

周震宇,沈 心

苏州市药品检验检测研究中心,苏州 215104

美罗培南为第2代广谱碳青霉烯类抗生素,大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌对其敏感,临床主要用于治疗多重耐药菌感染及各种严重感染[1-3]。美罗培南的现行质量标准为《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版二部[4],采用气相内标法控制溶剂的残留量,以乙醇为内标,测定产品中丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氢呋喃的残留量。但通过对美罗培南原料药合成路线的调研,发现不同生产企业的合成工艺略有不同,部分生产企业除现行标准中限制使用的有机溶剂外,还会使用甲醇和乙醇作为溶媒,两者均为《中国药典》2020年版四部[5]通则0861和《药品注册的国际技术要求(质量部分)》(ICH Q3C)[6]中明确规定需要控制的溶剂。其中甲醇属于第二类溶剂,应限制使用;乙醇属于第三类溶剂,为药品GMP或其他质量要求限制使用的溶剂。故需增加对这2种有机溶剂残留量的控制[7]。

本文建立同时测定甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氢呋喃的顶空气相色谱法[8-13],并对收集到的6家生产企业的美罗培南原料药进行检测,经方法学验证,该方法准确、可靠。相较于现行质量标准和已报道的文献中的方法[14-16],本文选择外标法进行定量分析,将原检测方法中的内标乙醇作为待测组分之一,使目标组分更全面,可覆盖国内美罗培南原料药不同生产企业所使用的有机溶剂,且样品处理步骤便捷,具有广泛适用性,能够有效控制产品质量以保证药品的安全性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890B/7697A型气相色谱仪、Agilent OpenLab Acquisition CDS 2.4色谱数据处理工作站(美国安捷伦科技有限公司);XSE205DU型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药

乙腈(批号U3YA1H,体积分数99.99%),甲醇(批号U81G1H,体积分数99.99%)均购自霍尼韦尔中国有限公司;四氢呋喃(批号WXBD0097V,体积分数99.9%,默克Sigma-aldrich公司);无水乙醇(批号20210119,体积分数99.7%),乙酸乙酯(批号20170824,体积分数99.5%),丙酮(批号20140107,体积分数99.5%),二氯甲烷(批号20160307,体积分数99.5%),均购自国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以体积分数6%氰丙基苯基-体积分数94%二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管气相色谱柱(DB-624 30 mm×0.32 mm,1.80 μm);载气为氮气;流速为1 mL·min-1;柱温为40 ℃;进样口温度为140 ℃,火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)温度为250 ℃;采用顶空分流进样,分流比为5∶1;顶空瓶平衡温度为90 ℃,平衡时间为30 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称定丙酮2.0 g、乙腈170 mg、二氯甲烷240 mg、乙酸乙酯2.0 g、四氢呋喃290 mg、乙醇2.0 g、甲醇1.2 g,置于100 mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;精密量取上述溶液1 mL,置于100 mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;精密量取上述溶液5 mL,置于20 mL顶空瓶中,摇匀,密封,即得。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称定美罗培南细粉0.2 g,置于20 mL顶空瓶中,精密加入水5 mL,摇匀,密封,即得。

2.2.3空白溶液的制备 精密量取水5 mL,置于20 mL顶空瓶中,密封,即得。

2.3 专属性实验

取上述对照品溶液、供试品溶液和空白溶液按照2.1项下色谱条件进样检测,各组分色谱峰的理论板数均不低于5 000,各色谱峰达到基线分离,空白溶液对测定无干扰。结果见图1。

注:A.空白溶液;B.对照品溶液;C.厂家A供试品溶液;D.厂家F供试品溶液;1.甲醇;2.乙醇;3.丙酮;4.乙腈;5.二氯甲烷;6.乙酸乙酯;7.四氢呋喃。

2.4 线性与范围

配制含丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇和甲醇的质量浓度分别为41.08、3.59、5.06、104.67、5.71、41.47、24.02 mg·mL-1的混合对照品储备液,逐级稀释配制线性系列溶液,按照2.1项下方法进行检测,记录色谱峰面积,以峰面积为横坐标(x)、质量浓度为纵坐标(y)进行线性回归。结果见表1。

表1 各组分线性关系、定量限和检测限

2.5 精密度实验

取对照品溶液,重复进样6次,记录峰面积。计算得丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和四氢呋喃峰面积的RSD值分别为3.81%、2.65%、5.33%、4.37%、2.19%、1.04%、4.12%,表明仪器具有良好的精密度。

2.6 重复性实验

平行制备6份供试品溶液(厂家A,批号821048 02),6份样品均仅检出丙酮,丙酮残留量的RSD值为2.50%,表明该方法的重复性良好。

2.7 稳定性实验

取对照品溶液,分别于室温下放置0、2、4、6、8、24 h,按照2.1项下方法测定,结果丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和四氢呋喃峰面积的RSD值分别为4.70%、3.64%、6.10%、5.70%、3.16%、2.54%、5.19%,表明对照品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 回收率实验

精密称定供试品(厂家A,批号82104802)细粉约0.2 g,共9份,置于20 mL顶空瓶中,按低、中、高3个质量浓度分别精密加入丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和四氢呋喃混合对照品溶液5 mL,密塞,摇匀,按照2.1项下色谱条件检测,用外标法以峰面积计算加样回收率。结果见表2。

表2 残留溶剂回收率实验结果

2.9 样品测定结果

对由6家美罗培南原料药生产企业提供的原料药样品进行残留溶剂检测,结果见表3。

表2(续) 残留溶剂回收率实验结果

表3 各生产企业美罗培南残留溶剂测定结果

由表3可知,由于各生产企业美罗培南原料药生产工艺存在差异,故各生产企业残留溶剂控制情况各有不同,本文建立的美罗培南残留溶剂测定法可有效区别美罗培南的生产工艺,控制溶剂的残留量。

3 讨论

3.1 方法的选择

由于部分企业在美罗培南的合成过程中使用乙醇,产品中可能会有一定量的乙醇残留,与现行执行标准中选择乙醇作为内标相冲突,现行标准对部分企业生产的美罗培南原料药残留溶剂的测定结果存在干扰。因此,建立顶空气相外标法,同时测定甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氢呋喃含量,具有更广泛的适用性。

3.2 溶剂的选择

现行质量标准中对照品以水作溶剂,美罗培南以质量浓度为10 g·L-1的碳酸钠溶液作溶剂,新增甲醇和乙醇2个组分,溶液中的钠盐可能会影响顶空瓶内的蒸汽压,影响最终的检测结果。经实验对比发现,碳酸钠的存在会对乙醇和乙酸乙酯的出峰造成影响,与以水作溶剂的对照品溶液相比,以质量浓度为10 g·L-1的碳酸钠溶液为溶剂的对照品溶液中,乙醇峰增大约0.5倍,乙酸乙酯峰消失,不同溶剂对供试品溶液的测定结果无影响,因此统一选择水作为溶剂。

3.3 限度讨论

参考现行质量标准及《中国药典》2020年版四部通则0861残留溶剂测定法[17-18],7种有机溶剂的限度分别为甲醇0.3%、乙醇0.5%、丙酮0.5%、乙腈0.041%、二氯甲烷0.06%、乙酸乙酯0.5%、四氢呋喃0.072%。参考ICH Q3C指导原则[19-20],生产企业也可以根据制剂的日用量及残留溶剂的每日允许最大暴露量(permitted daily exposure,PDE)进行风险评估后,确立限度,建议各生产企业可适当收紧限度。