杜仲木香散的质量标准研究

谢晓林,张德柱,马 钊,李 娟,梁承远*,乔乖萍,惠 楠,王 珺,3

1.陕西盘龙药业集团股份有限公司,西安 710021;2.陕西科技大学食品与生物工程学院,西安 710021;3.青海省药品检验检测院 青海省中藏药现代化重点实验室,西宁 810000

杜仲木香散出自明代董宿原所著《奇效良方》,其处方是“杜仲(炒去丝)4两,木香4两,官桂1两”,是此3味药经过粉碎混合制成的复方中药方剂[1]。方中杜仲补肝肾、强筋骨、暖下元,肾充则骨强,肝充则筋健[2-4];木香行气止痛,通行三焦滞气[5];官桂下行而补肾,温阳而通脉[6-7]。三药合用,共奏温阳活血、行气止痛之功,适用于寒湿内阻、气血不畅之腰痛。使用方法为“空心温酒送服,每服二钱”[1]。杜仲木香散最早使用于明清时期,历史悠久,因其组成较简单,主药杜仲、木香为常用药材,易获得且安全范围大,故被广泛使用,具有良好的开发前景。

中药质量标准是保障安全用药的重要手段之一,是国家或者药品行业对中药材或中药产品的质量和相应的检验方法做出的技术规定[8-9],我国目前关于杜仲木香散的研究报道很少,现行药典及部颁标准中均未收录其质量标准,限制了杜仲木香散的应用。因此,本研究建立以杜仲、木香原药材为对照的显微鉴别方法。此外,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定杜仲木香散中木香烃内酯、京尼平苷酸的含量,将其作为检测和控制该方剂的含量指标。从而完整地表征该方剂的性质,完善其质量标准,使该方剂的使用更加安全、可靠,也为后续基于该方剂的制剂产品的开发提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

奥林巴斯BX43型生物显微镜(南京鼎诚精密仪器有限公司);岛津LC-16型高效液相色谱仪、FA1204C型电子天平、WT20000X型电子天平均购自常州万泰天平仪器有限公司;YM-100S型超声波清洗机(44 kHz,深圳市方奥微电子有限公司);RS-FS1401型多功能粉碎机(合肥荣事达小家电有限公司)。

1.2 试药

木香烃内酯对照品(批号111524-201911,质量分数为98%)、京尼平苷酸对照品(批号111282-201805,质量分数为98%),均来源于中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈,均为色谱纯,均购自赛默飞世尔科技有限公司;磷酸(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);水为超纯水;甲醇(天津市天力化学试剂有限公司);氯仿等试剂均为分析纯。

木香(批号:2020103～20201107、20201114～20201118)、杜仲(批号:20200325～20190329、20200406～20200410)以及肉桂(批号:20200303～20200307、20200406～20200410)药材均购自陕西中药材万寿路药材市场,经青海省药检所中药室王珺鉴定木香为菊科植物木香(AucklandialappaDecne.)的干燥根,杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommiau1moidesOliv.)的干燥树皮,肉桂为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥树皮,符合2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)一部项下对各味药材基原的规定。

2 方法

2.1 显微鉴别

中药制剂显微鉴别研究一般常用于鉴别由饮片粉末制成的制剂,如丸、散、片、胶囊中药材的鉴别[10],具有简便、快速的特点,是中药鉴别的重要手段[11]。

通过对木香和杜仲原药材以及制剂进行显微观察,对比制剂中这2味药材的显微特征。

2.1.1原药材显微样品的制备 取杜仲和木香中药材粉末少许,置于载玻片上,滴加适量水合氯醛试液,盖上盖玻片,擦除盖玻片周围的药液,即得。

2.1.2杜仲木香散粉末显微样品的制备 取杜仲木香散粉末少许,置于载玻片上,滴加适量水合氯醛试液后,盖上盖玻片,擦除盖玻片周围的药液,即得。

2.2 含量测定

木香和杜仲原药材均为2020年版《中国药典》收载品种。《中国药典》对木香含量测定指标成分为木香烃内酯和去氢木香内酯,以二者的总含量反映药材是否符合质量标准[12]。但通过预实验发现,在杜仲木香散中,去氢木香内酯含量低难以被检出,故不在该方剂中建立单独检测去氢木香内酯或同时检测去氢木香内酯和木香烃内酯的方法;通过预实验发现,该方剂中木香烃内酯能被检出,经一系列方法学考察,最终确立用检测木香烃内酯(结构式见图1)的HPLC法考察制剂的含量[13-15]。

《中国药典》中规定杜仲的含量测定指标成分为松脂醇二葡糖糖苷[12],但松脂醇二葡萄糖苷含量低且分离度较差,未能在方剂中建立其检测方法。经过实验,发现杜仲的另一种有效成分京尼平苷酸可被检测出。经一系列方法学考察,最终确立用检测京尼平苷酸(结构见图1)的HPLC法考察制剂中的杜仲含量[16-17]。

注:A.木香烃内酯;B.京尼平甘酸。

2.2.1木香烃内酯的含量测定

2.2.1.1色谱条件 色谱柱:Hypersil C18ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-水(65∶35)为流动相;流速:0.8 mL·min-1;检测波长:225 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3 000。

2.2.1.2溶液的配制 供试品溶液的配制:精密称取样品3 g,置于具塞锥形瓶中,精密量取氯仿50 mL,密塞后称定质量,超声(40 kHz,250 W)处理45 min,放冷,再次称定质量,用氯仿补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得;阴性制剂样品溶液的配制:按杜仲木香散处方比例缩小,称取杜仲4 g,肉桂1 g,2味药材混合制备含木香阴性样品溶液,按供试品溶液的制备方法制成不含木香的阴性制剂样品溶液;木香烃内酯对照品溶液的配制:精密称取木香烃内酯对照品5.0 mg,置于10 mL量瓶中,加氯仿定容至刻度,制备质量浓度为0.5 mg·mL-1的木香烃内酯对照品溶液,密封后置于4 ℃冰箱中避光保存。

2.2.2京尼平苷酸的含量测定

2.2.2.1色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以甲醇为流动相A,以1 mL·L-1磷酸水溶液为流动相B,梯度洗脱(0→10 min,5%→8%A;10→15 min,8%→10%A;15→20 min,10%→15%A;20→35 min,15%→20%A;35→40 min,20%→35%A)。流速:0.8 mL·min-1。检测波长:230 nm。柱温:30 ℃。进样量:10 μL。理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于2 000。

2.2.2.2溶液的配制 供试品溶液的配制:精密称取样品3 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入体积分数为30%的甲醇50 mL,密塞后称定质量,超声(40 kHz,250 W)处理30 min,放冷,再称定质量,用体积分数为30%的甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得;阴性制剂样品溶液的配制:按杜仲木香散处方比例缩小,称取木香4 g,肉桂1 g,2味药材混合配制含杜仲阴性样品溶液,按供试品溶液的配制方法制成不含杜仲的阴性制剂样品溶液。京尼平苷酸对照品溶液的配制:精密称取京尼平苷酸对照品5.0 mg,置于50 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成质量浓度为100 μg·mL-1的京尼平苷酸对照品溶液,密封后置于4 ℃冰箱中避光保存。

3 结果与讨论

3.1 显微鉴别结果

3.1.1木香药材 网纹导管多见,也可见螺纹导管。菊糖极多。木栓细胞呈淡黄褐色,类似多角形,排列不甚整齐,大小差异不一。有时可见油室碎片,内含分泌物。木纤维多成束,黄色,末端倾斜或细尖,呈长梭形,非木化或微木化。纹孔细小,横裂呈缝状或相交人字形、十字形[18]。见图2。

注:A-B.网纹导管;C.菊糖;D.木栓细胞;E.油室;F.木纤维。

3.1.2杜仲药材 木栓细胞成群或单个散离,呈多角形,木化,胞腔内含有橙红色物质,断面呈长方形,且孔沟明显。橡胶丝呈细长条状,稍弯曲或扭曲成团,表面略粗[19]。见图3。

注:A.木栓细胞;B.橡胶丝。

3.1.3杜仲木香散 粉末为棕褐色,可见网纹导管、螺纹导管,菊糖可见且较易观察(木香);还可见细长的条状橡胶丝以及成群或单个存在的木栓细胞(杜仲)。见图4。由于制剂中杜仲和木香显微特征明显,故可将显微鉴别作为杜仲木香散的质量控制标准。

注:1.螺纹导管;2.菊糖;3.网纹导管;4.木栓细胞;5.橡胶丝。

3.2 含量测定结果

3.2.1木香

3.2.1.1专属性实验 分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液,按2.2.1.1项下色谱条件进样。木香烃内酯对照品和供试品溶液中木香烃内酯峰保留时间一致且峰形对称,阴性样品在相应保留时间附近处无干扰峰出现,表明该方法的专属性良好。见图5。

注:A.供试品溶液;B.对照品溶液;C.阴性样品溶液;1.木香烃内酯。

3.2.1.2线性关系实验 取2.2.1.2项下配制的木香烃内酯对照品储备液,加氯仿制成质量浓度为10.00、20.00、50.00、60.00、100.00 μg·mL-1的系列对照品溶液,按照2.2.1.1项下色谱条件进样进行分析,记录峰面积。以峰面积为纵坐标(y)、对应的进样质量浓度为横坐标(x),绘制标准曲线,计算回归方程。木香烃内酯的回归方程为:y=17 000.46x+24 802.33,R2=0.998,线性范围为10.00～100.00 μg·mL-1。

3.2.1.3精密度实验 取同一杜仲木香散供试品溶液,按2.2.1.1项下色谱条件重复进样6次,记录色谱峰的峰面积,木香烃内酯色谱峰面积的RSD值 (n=6)为2.06%,表明仪器的精密度良好。

3.2.1.4稳定性实验 取杜仲木香散3 g,按照2.2.1.2项下方法制备供试品溶液,并按照2.2.1.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析,记录色谱峰面积。计算得木香烃内酯色谱峰面积的RSD值为1.78%,表明样品在24 h内稳定性良好。

3.2.1.5重复性实验 取同一批杜仲木香散3 g,按照2.2.1.2项下方法,平行制备6份样品,按2.2.1.1项下色谱条件,进样分析,记录木香烃内酯的峰面积,杜仲木香散中木香烃内酯的平均含量为0.351 mg·g-1,计算得峰面积的RSD值为1.60%,表明该方法的重复性良好。

3.2.1.6回收率实验 精密称定已知含量的同一批杜仲木香散样品6份,每份1.5 g,其中木香烃内酯的含量为0.351 mg·g-1,精密加入质量浓度为600.00 μg·mL-1的对照品溶液1.00 mL,按照2.2.1.2项下方法制备供试品溶液,按2.2.1.1项下色谱条件进样,记录色谱峰面积,见表1。杜仲木香散的平均回收率为99.79%,RSD值 (n=6)为2.49%,表明该方法的回收率良好。

表1 木香烃内酯回收率实验结果

3.2.1.7检测限和定量限 配制质量浓度为10 μg·mL-1的木香烃内酯对照品溶液进行逐步稀释,当木香烃内酯的质量浓度为0.50 μg·mL-1时,进样分析,检测信号约为噪音的10倍,得定量限为0.50 μg·mL-1。当木香烃内酯的质量浓度为0.16 μg·mL-1时,进样分析,检测信号约为噪音的3倍,得检测限为0.16 μg·mL-1。

3.2.1.8耐用性实验 考察该方法在使用不同色谱柱时,在岛津LC-16型高效液相色谱仪上的耐用性。比较3种不同品牌的硅胶键合C18柱[Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);NewmateTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]。取同一份杜仲木香散供试品溶液,分别于上述3种色谱柱上样。见图6。由图6可见,应用3种不同品牌的色谱柱分离样品中的木香烃内酯时,分离度均良好,表明该方法在使用不同的C18柱时,耐用性良好。

2.对生物多样性和特异性的认识，以及对基因重组作为生物变异主要来源的认识，为知识的灵活应用奠定了基础。

注:A.Hypersil ODS C18柱;B.NewmateTM C18柱;C.Kromasil 100-5-C18柱;1.木香烃内酯。

3.2.1.9杜仲木香散中木香烃内酯的含量测定 取实验室自制的15批杜仲木香散样品,按照2.2.1.2项下方法制备供试品溶液,并按照2.2.1.1项下色谱条件进样进行木香烃内酯含量的测定。见表3、图9。木香烃内酯含量在0.612～1.023 mg·g-1之间,平均含量为0.776 mg·g-1。按平均值下浮20%计,规定本品中木香烃内酯的含量不得少于0.621 mg·g-1。

3.2.2杜仲

3.2.2.1专属性实验 分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液,按照2.2.2.1项下色谱条件进样。京尼平苷酸对照品和样品中京尼平苷酸峰保留时间一致且峰形对称,阴性样品在相应保留时间附近处无干扰峰出现,表明该方法的专属性良好。见图7。

注:A.供试品溶液;B.对照品溶液;C.阴性样品溶液;2.京尼平苷酸。

3.2.2.2线性关系实验 取2.2.2.2项下制备的京尼平苷酸对照品溶液,加甲醇制成质量浓度分别为10.00、20.00、30.00、40.00、60.00 μg·mL-1的系列京尼平苷酸对照品溶液,按照2.2.2.1项下色谱条件进样分析,记录峰面积。以峰面积为纵坐标(y)、对应的进样质量浓度为横坐标(x),绘制标准曲线,计算回归方程。京尼平苷酸的回归方程为:y=12 044.09x-7 745.54,R2=0.999,线性范围为10.00～60.00 μg·mL-1。

3.2.2.3精密度实验 取同一杜仲木香散供试品溶液按2.2.2.1项下色谱条件重复进样6次,记录色谱峰面积。计算得京尼平苷酸色谱峰面积的RSD值 (n=6)为1.08%,表明仪器的精密度良好。

3.2.2.4稳定性实验 取杜仲木香散3 g,按照2.2.2.2项下方法配制供试品溶液,并按照2.2.2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析,记录色谱峰面积。计算得京尼平苷酸色谱峰面积的RSD值为1.53%,表明供试品在24 h内稳定。

3.2.2.5重复性实验 取杜仲木香散3 g,按照2.2.2.2项下方法,平行制备6份样品,按照2.2.2.1项下色谱条件进样分析,记录京尼平苷酸的峰面积,杜仲木香散中京尼平甘酸的平均含量为0.380 mg·g-1。计算得峰面积的RSD值为1.44%,表明该方法的重复性良好。

3.2.2.6回收率实验 精密称定已知含量的同一批杜仲木香散样品6份,每份约1.5 g,其中京尼平苷酸的含量为0.380 mg·g-1,精密加入质量浓度为600.00 μg·mL-1的对照品溶液1.0 mL,按照2.2.2.2项下方法配制供试品溶液,按照2.2.2.1项下色谱条件进样,记录色谱峰面积。京尼平甘酸的平均回收率为100.68%,RSD值 (n=6)为1.69%,见表2。结果表明,该方法的回收率良好。

表2 京尼平苷酸回收率实验结果

3.2.2.8耐用性实验 考察了应用不同色谱柱[Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);HiQ sil C18W柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]时该方法的耐用性。取同一份杜仲木香散供试品溶液,分别于上述3种色谱柱上进样。结果见图8。由图8可见,3种不同品牌色谱柱分离样品中的京尼平苷酸的分离度均良好,表明该方法在采用不同的C18柱时,耐用性良好。

注:A.Kromasil 100-5-C18柱;B.Hypersil ODS C18柱;C.HiQ sil C18W柱;2.京尼平苷酸。

3.2.2.9杜仲木香散中京尼平苷酸的含量测定 取实验室自制的15批杜仲木香散样品,按照2.2.2.2项下方法配制供试品溶液,并按照2.2.2.1项下色谱条件进样进行京尼平苷酸的含量测定。见表3、图9。京尼平苷酸含量在0.278～0.493 mg·g-1之间,平均含量为0.361 mg·g-1。按平均值下浮20%计,暂定本品京尼平苷酸含量不得少于0.289 mg·g-1。

注:A.木香供试品溶液;B.杜仲供试品溶液;1.木香烃内酯;2.京尼平苷酸。

表3 样品含量测定结果

4 结论

药品质量标准是药品检验的准绳,制定科学、合理的质量标准是保障用药安全的重要手段之一[20-22]。本研究通过对15批实验室自制杜仲木香散进行质量标准研究,建立了杜仲和木香的定性鉴别(显微鉴别)和定量控制方法,建立了木香烃内酯和京尼平苷酸的含量测定方法,方法学考察良好,木香烃内酯的含量范围为0.612～1.023 mg·g-1,京尼平苷酸的含量范围为0.278～0.493 mg·g-1。

按照本研究建立的药品标准检验,15批杜仲木香散均符合标准,且质量较稳定。本文为杜仲木香散质量标准的建立和剂型开发奠定了一定的研究基础。