Box-Behnken响应面法优化葡萄籽原花青素柔质体的制备工艺

窦 晨,赵声兰,丁 雄,林柳任,马云淑,潘 蕊,程 欣

云南中医药大学中药学院 云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室 云南省傣医药与彝医药重点实验室,昆明 650500

葡萄籽、葡萄皮作为葡萄酒酿造过程中的边脚料常被作为废弃物丢弃,但这些废弃物中含有丰富的多酚,可作为一种生态可持续和低成本的天然抗氧化剂来源。其中葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)由于含量高、活性好,具有抗癌[1]、抗菌[2]、抗氧化清除自由基[3]、抗炎[4]、抑制黑色素的生成[5]等药理学活性,受到了研究者们的广泛关注。有研究发现,与维生素C和维生素E琥珀酸酯相比,GSP是更有效的抗氧化剂和自由基清除剂[6],萄萄籽中多酚类物质的含量可达5%～8%,在这些多酚类物质中,以原花青素含量最高。GSP主要是由儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯聚合而成的二聚体及多聚体[7]。随着聚合度不同表现出不同的理化性质,低聚原花青素有较强的抗氧化活性,颜色呈白色或浅黄色。高聚原花青素主要是原花青素缩合后的产物,颜色呈红色,水溶性较差,抗氧化活性比低聚体低,常用作染色剂、食品着色剂[8]。由于GSP分子结构中的不饱和键和强大的抗氧化能力使其易受光、热、酶、金属离子、氧气和酸碱度的影响变得极不稳定[9];并且由于其水溶性小,导致生物利用度降低;其具有涩味和苦味,这些性质限制了原花青素在食品、药品、化妆品领域的广泛使用。

脂质体是具有磷脂双分子层的封闭囊泡状结构,主要由磷脂或磷脂分子组成,能够包载具有不同性质(如亲水性、亲脂性和两亲性)的药物分子,从而增加被包封药物分子的稳定性和功能性,增大药物的溶解度,提高药物的稳定性。传统的囊泡体(脂质体和囊泡)不能有效地通过皮肤进行透皮传递,而是局限在皮肤的表层,因此添加丙二醇、胆酸钠作为边缘活化剂的柔性纳米脂质体,由于其具有柔韧性和可变形性,故更容易进行透皮传递[10-11]。本实验采用薄膜分散超声法[12]制备GSP-LPs,用响应曲面法对其制备工艺进行优化,考察其体外释放特性,为进一步开发利用GSP奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JEM-1400PLUS型透射电子显微镜、Brookhaven 190Plus型纳米激光粒度仪均购自美国布鲁克海文公司;电子天平(奥斯豪仪器有限公司);台式高速大容量冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司);TK-12B型透皮扩散池(上海市锴凯科技贸易有限公司);FS-300N型超声波处理器(上海生析超声仪器有限公司);旋转蒸发仪(昆明倍捷科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予化仪器有限责任公司)。

1.2 试药

原花青素对照品(批号1024K021SX,质量分数≥95%,北京索莱宝科技有限公司);葡萄籽原花青素(批号002200604028,质量分数≥95%,天津市尖峰天然产物研究开发有限公司);大豆卵磷脂(批号1112J021,北京索莱宝科技有限公司);胆固醇(批号624J033),脱氧胆酸钠(批号909P021,质量分数>99%)均购自北京兰杰柯科技有限公司;香草醛(批号C10083717,上海麦克林生化科技有限公司);盐酸(批号20150518)、三氯甲烷(批号20150610)均购自云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司;甲醇(批号20201014,分析纯,天津市致远化学试剂有限公司);1,2-丙二醇(批号C10561784,上海麦克林生化科技有限公司)。

1.3 动物

SPF级KM小鼠,雄性,体质量(20±2) g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号SCXK(湘)k2017-0005。

2 方法与结果

2.1 香草醛盐酸显色法测定原花青素含量

2.1.1香草醛盐酸显色法实验原理 基于酚醛缩合反应,原花青素分子中的间苯三酚在酸催化下与香草醛(香兰素C8H8O3)发生缩合而形成有色的碳正离子,使原花青素分子产生红色的发光基团[13](λ=500 nm)。原花青素或(+)-儿茶素可作为对照品。(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素单体及其低聚体等都能参加反应,可同时测定单体和聚合体的总含量。

2.1.2显色剂的配制 精密称定2 g香草醛置于50 mL量瓶中,加入甲醇溶解,定容至50 mL,再加入1.5 mL盐酸,混匀,即得。

2.1.3最大吸收波长的确定[14]配制一定质量浓度的原花青素对照品的甲醇溶液,取0.5 mL,置于试管中,加入3 mL香草醛甲醇溶液及1.5 mL盐酸,摇匀,于20 ℃恒温水浴中避光反应15 min后,以试剂为空白对照溶液,用紫外可见分光光度计在400～800 nm的波长范围内进行全波长扫描。结果显示,其在500 nm波长处有最大吸收。见图1。

注:a.GSP甲醇溶液的吸收峰;b.甲醇溶液的吸收峰。

2.2 测定原花青素含量紫外分光光度法的建立

2.2.1线性关系考察 精密称定葡萄籽原花青素对照品5.36 mg,加入甲醇定容至10 mL,梯度稀释配制成质量浓度为0.05～0.46 mg·mL-1的对照品溶液。分别精密量取0.5 mL不同质量浓度的对照品溶液置于试管中,分别精密量取3 mL体积分数为4%的香草醛甲醇溶液及1.5 mL盐酸加入试管中,充分摇匀,于20 ℃水浴中反应15 min后,于500 nm处测定其吸光度值,绘制吸光度-质量浓度标准曲线。数据分析后拟合的标准曲线为y=1.997x+0.014 7(R2=0.999 4)。表明原花青素质量浓度在0.05～0.45 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.2精密度实验 配制质量浓度分别为0.5、0.25、0.125 mg·mL-1的葡萄籽原花青素样品溶液,连续6次测定其吸光度值,平均吸光度值分别为0.642、0.313、0.155,RSD值分别为0.14%、0.24%、0.33%。表明仪器的精密度良好。

2.2.3稳定性实验 取1 mL 2.3.1项下制备的葡萄籽原花青素柔质体,加入一定量的甲醇超声破乳后静置至上清液澄清,用同法处理的空白脂质体调零,分别于0、2、4、6、8、12 h测定其在500 nm处的吸光度值,吸光度值分别为0.663、0.668、0.664、0.678、0.666、0.668,RSD值为0.84%。表明样品在12 h内稳定性良好。

2.2.4加样回收率实验 配制质量浓度分别为0.69、1.45、2.17 mg·mL-1的葡萄籽原花青素对照品溶液,取1 mL空白脂质体3份分别加入2 mL不同质量浓度的对照品溶液,再分别加入一定量的甲醇超声破乳后,取澄清上清液0.5 mL。根据2.2.1项下的方法测定其吸光度值(A),根据回归方程计算得药物含量(m)。加样回收率=(加入量/测得量)×100%。结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.3 GSP-LPs的制备

2.3.1薄膜分散超声法制备葡萄籽原花青素柔质体 精密称取处方量的卵磷脂、胆固醇溶于15 mL氯仿,脱氧胆酸钠置于5 mL甲醇中超声溶解。将上述2个组分置于圆底烧瓶中混合均匀,于40 ℃水浴减压旋转蒸发除去有机溶剂,直至在瓶壁形成透明、干燥、均匀的脂质薄膜。精密称取处方量葡萄籽原花青素溶于6 mL水中,作为水相,将水相置于圆底烧瓶中,于40 ℃水浴中旋转水合30 min,将所得混合液置于超声波处理器中,超声混匀(150～180 W,5 min),用0.22 μm微孔滤膜过滤即得,置于4 ℃密封保存。

2.3.2包封率、载药量测定方法 精密量取1 mL 2.3.1项下制备的柔质体,加入1.2 mL 1 mol·mL-1盐酸溶液静置使其絮凝[15-16],以18 000 r·min-1离心20 min后,取上清液,以溶剂调零,测定上清液的吸光度值(A1)。另精密量取1 mL柔质体,加入甲醇超声使其破乳后静置至上清液澄清,弃去底部白色絮状沉淀,用同法处理的空白脂质体调零,测定吸光度值(A2)。将A1、A2带入2.2.1项下的回归方程,计算出游离药物含量M1及总药量M总,脂质体总质量记为M2,根据公式计算出脂质体的包封率和载药量。包封率(EE)=[(M总-M1)/M总]×100%。载药量=[(M总-M1)/M2]×100%。

2.3.3处方工艺优选 通过查阅文献及单因素实验[17],确立了对脂质体包封率影响比较显著的3个因素,即卵磷脂的质量浓度(x1)、卵磷脂与胆固醇的比(x2)、胆酸钠的用量(x3),将其作为响应面的3个因素,并将包封率(y1)、粒径(y2)、PDI(y3)作为响应值,实验结果见表2。

据《后汉书》《三国志》载，陶谦与曹操对战地点是在徐州，治所后来迁到山东郯城；陶谦死后，刘备接任徐州牧时，治所应已移至下邳，因为吕布是从刘备手中夺了下邳，并自封徐州刺史，治所就在下邳。直到魏明帝时，徐州刺史部治所才移到彭城（徐州）。但《三国演义》中，说刘备、吕布的治所都是在徐州，这样，为了解释吕布何以是在下邳被缢死，就不得不添补一些情节。《三国演义》作者被认为是明朝吴贯中；明洪武年间，下邳县已属邳州，并另建新城，古下邳城的重要性大大降低。吴贯中不知是误会，还是有意，将战争重心移到了徐州，这与历史不符。

表2 GSP-LPs优选的响应曲面实验结果

根据各指标的拟合方程,固定一个因素水平,用Design-Expert 8.0.6软件分别绘制各评价指标与另外2个考察因素的三维曲面图,见图2。根据响应曲面拟合结果得最优处方为x1=12.5 mg·mL-1,x2=15∶1,x3=15 mg。根据该优化处方制备5批样品,结果包封率为70.79%±0.02%,载药量为1.16%±0.01%,PDI为0.26±0.01,与预测值(包封率70.25%,PDI=0.224)比较,偏差均<5%。实测粒径为(156.47±7.03) nm,虽然与预期粒径(167.43 nm)存在一定差别,但保持着较小的粒径范围。说明拟合方程所建立的模型具有良好的预测性,工艺稳定、可行。

图2 各因素对GSP-LPs的PDI、包封率和粒径影响的三维响应曲面图

2.3.4GSP-LPs的粒径及Zeta电位检测 取适量制备的GSP-LPs混悬液,加适量水稀释后,用激光粒度仪测定其粒径、PDI及Zeta电位。葡萄籽原花青素柔质体的粒径为(156.47±7.03) nm,PDI为(0.26±0.01),电位为(-42.35±4.00) mV (n=5),制得的柔质体粒径分布均匀,且集中分布于100～150 nm范围内,稳定性良好。结果见图3。

注:A.GSP-LPs的Zeta电位;B.粒径分布。

2.3.5GSP-LPs的外观及形态观察 将2.3.1项下制备的空白柔质体(blank flexiblenano-liposomes,B-LPs)及GSP-LPs混悬液置于透明西林瓶中,观察其外观,葡萄籽原花青素柔质体为红棕色乳液。吸取1滴柔质体混悬液置于载玻片上,将铜网倒扣于液体上,用醋酸铀对样品进行负染,待样品晾干后,在TEM透射电镜下进行观察。结果见图4。由图4可见,柔质体形态为类圆球形且分布均匀。

注:A.GSP-LPs透射电镜图(×80 000);B.GSP-LPs的外观。

2.4 体外经皮渗透实验

2.4.1离体小鼠皮肤的制备 将昆明种小鼠脱颈椎处死后,固定于木板上,用剃须机小心剔除腹部毛,立即剪下其腹部皮肤,剥离皮下组织及脂肪,将其浸泡于生理盐水中,选取表皮完整无破损的皮肤置于-80 ℃保存,备用。

2.4.2经皮渗透实验 采用Franz透皮扩散池法,以游离GSP为对照进行GSP-LPs体外经皮渗透实验。首先将预处理好的鼠皮固定于透皮杯上,使角质层面向供给池,用夹子夹紧。再加入体积分数为30%的乙醇溶液-生理盐水,将其作为接收介质并排出气泡,于水浴温度(32±0.5) ℃、转速300 r·min-1的条件下进行实验。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取样2 mL,同时补加等量同温度的接收介质。最后将接收液用0.22 μm的微孔滤膜过滤后,计算原花青素在不同时间点单位面积的累积透过量(Q),以时间(t)为横坐标(x)、单位面积的累积透过量(Q)为纵坐标(y)做图。结果见图5。

图5 GSP、GSP-LPs药物单位面积累积透过量曲线

分别采用零级释放动力学方程、一级释放动力学方程、Higuchi方程、Weibull方程、Ritger-peppas方程对体外释放结果进行拟合。结果见表3。结果显示,以Weibull方程拟合时GSP、GSP-LPs均具有较高的拟合度,其相关系数分别为0.998 4、0.997 5,表明二者的释放规律符合Weibull方程。

表3 GSP、GSP-LPs药物单位面积累积透过量曲线方程拟合

2.4.3药物的体外释放考察 精密量取葡萄籽原花青素柔质体、原花青素溶液2 mL,置于透析袋(相对分子质量100 000)中,以8 mL体积分数为30%的乙醇溶液-生理盐水为释放介质,于Franz体外透皮扩散池上以300 r·min-1的转速恒温(37±0.5) ℃进行实验。分别于0.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h取样2 mL,同时补加等量同温度的释放介质,接收液用0.22 μm的微孔滤膜过滤后,取0.5 mL于500 nm处测定药物的吸光度值,计算药物的累积释放量。

累积释放率=累积释放量/投药量。

以时间为横坐标(x)、药物累积释放率为纵坐标(y)作图,结果见图6。

图6 GSP、GSP-LPs药物累积释放率曲线

分别采用零级释放动力学方程、一级释放动力学方程、Higuchi方程、Weibull方程、Ritger-peppas方程对体外释放结果进行拟合。结果见表4。结果显示,以Weibull方程拟合时GSP、GSP-LPs均具有较高的拟合度,其相关系数分别为0.998 9、0.998 1,表明二者的释放规律均符合Weibull方程。

表4 GSP、GSP-LPs药物累积释放率曲线方程拟合

3 讨论

葡萄籽原花青素由于具有清除自由基、抗氧化活性而成为具有开发潜力的天然抗氧化剂来源。通过剂型设计可以减少药物自身存在的缺点,增加药物的生物利用度,使葡萄籽原花青素得到进一步开发、利用。将GSP包载于脂质体后可以增加其溶解度、提高其稳定性,有利于将其开发为缓控释制剂。有研究表明,由于原花青素的抗氧化效果,将其包载于脂质体可以减少磷脂双分子层的氧化,同时可以增加药物的稳定性[18],并且能够掩盖葡萄籽原花青素的苦味和涩味,可作为食品和饮料工业中的抗氧化剂[19],使其具有广泛的应用前景。

在本研究中采用脱氧胆酸钠作为膜软化剂制备脂质体,将脱氧胆酸钠溶于有机系,能够大大缩短制备过程中的膜洗脱时间,增大脂质体的包封率。在实验中发现,GSP-LPs的粒径会随胆固醇用量的增加逐渐变大,另外延长超声时间、增大超声功率可以显著减小其粒径,但仍需根据实际情况调整。采用响应曲面法优化GSP-LPs的制备工艺,实验结果准确、可靠。透皮释放实验结果显示其释放符合Weibull释放规律。与游离的药物相比,GSP-LPs显著延长了药物的释放时间,有望将其制备为缓释制剂,使GSP得到进一步的开发、利用。