白芍总苷对排卵障碍大鼠排卵功能的作用

顿彩虹,白爱红,谢文燕,戚静宜

1.漯河市妇幼保健院生殖遗传科,漯河 462000;2.洛阳市中心医院生殖医学科,洛阳 471699

排卵障碍是女性不孕的重要原因之一,占25%～40%,表现为肥胖、多毛、功能失调性子宫出血、闭经等症状,并显著增加乳腺癌、子宫内膜癌等风险[1-2]。中医诸多先贤指出肝在女性生殖中起关键性作用,在月经紊乱、不孕症治疗上多从肝调治,疏肝法亦被证实疗效显著[3-4]。白芍苦酸微寒,可养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳,是多种助孕方剂中的常用组方,白芍总苷为白芍的主要成分,具有抗炎、镇痛、保肝、抑制自身免疫反应等多种药理活性[5],李赛等[6]证明白芍在促卵泡发育、促排卵方面有一定作用。TGF-β1/Smads信号转导通路在卵泡发育期间发挥重要作用,转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)在卵巢不同发育阶段均有表达,可通过旁分泌或自分泌机制参与卵巢卵母细胞成熟、颗粒细胞增殖等生理过程,调节多种关键颗粒细胞酶,在维持卵巢良好内环境中扮演重要角色。本研究通过建立排卵障碍大鼠模型,观察白芍总苷干预效果,并探讨其相关机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Varioskan LUX型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);RM2265型病理切片机(德国徕卡微系统有限公司)。

1.2 试药

白芍总苷(国药准字H20055058,宁波立华制药有限公司);TGF-β1/Smads通路抑制剂SB431542(质量分数>99%,美国Abcam公司);羟基脲(国药准字H11020569;0.25 g,北京永正制药有限责任公司);促黄体素(lutropin,LH),卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH),雌二醇(estradiol,E2)放射免疫分析试剂盒(上海谷研实业有限公司);抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)酶联免疫试剂盒(上海柯雷生物科技有限公司);TGF-β1、Smad4、Smad3、p-Smad3一抗(美国Santa Cruz公司)。

1.3 动物

70只SPF级SD雌性大鼠,未交配,60日龄,体质量(230±20) g,购自安泰康生物技术(北京)有限公司,使用许可证号SYXK(京)2019-0047。在室温22～24 ℃、相对湿度40%～70%的环境中饲养,光照、黑暗12 h交替,自由饮食、饮水。适应性喂养1周,每天早上8点观察阴道分泌物涂片,其中有规律动情周期的有60只,纳入后续实验。

2 方法

2.1 模型建立与分组

60只大鼠随机抽取10只作为健康组,其余50只建立排卵障碍模型。模型组连续11 d根据体质量用羟基脲悬浊液0.01 mL·g-1灌胃,健康组连续11 d灌胃等量生理盐水。从灌胃第7天开始做阴道分泌物涂片,连续2个周期。健康组动情周期4～5 d,建模大鼠动情周期紊乱,推迟7～9 d甚至消失,停滞在动情间期[7]。40只大鼠动物周期消失,纳入后续实验,随机分为排卵障碍组、抑制剂组、白芍总苷组、抑制剂+白芍总苷组,各10只。

2.2 干预方式

建模成功后,抑制剂组以SB431542 5 mg·kg-1腹腔注射;白芍总苷组以白芍总苷200 mg·kg-1灌胃;抑制剂+白芍总苷组采用SB431542及白芍总苷干预,用法及用量同抑制剂组、白芍总苷组;健康组、排卵障碍组与抑制剂组用等体积生理盐水腹腔注射,与白芍总苷组等体积生理盐水灌胃。1日1次,连续干预4周。

2.2.1组织取材 动情期间禁食不禁水24 h,戊巴比妥钠腹腔麻醉,腹主动脉取血8～10 mL,静置30 min,以3 500 r·min-1离心15 min,分离血清保存于-80 ℃备用;血液采集完成后,断头处死大鼠,解剖、分离卵巢,清除周围脂肪,用预冷生理盐水冲洗,分为2份,1份用质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛固定,1份保存于液氮中。

2.2.2检测血清性激素、AMH水平 取冷冻保存血清,采用双抗体放射免疫法检测血清LH、FSH和E2水平;采用酶联免疫吸附试验检测血清AMH水平,严格按照试剂盒说明书要求设计检测流程,用酶标仪测定570 nm处的吸光度值,以对照品质量浓度为横坐标(x)、吸光度为纵轴坐标(y)绘制标准曲线,根据标准曲线计算AMH水平。

2.2.3HE染色观察卵巢形态学变化 取用质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛固定的卵巢组织,自动脱水机脱水、透明和浸蜡,56 ℃石蜡包埋,冷冻30 min后制成4 μm连续切片。HE染色后用中性树胶封片,于光学显微镜下观察卵巢形态学变化,并随机选取5个不相邻的视野,计单侧卵巢中的成熟卵泡数、生长卵泡数、黄体数。

2.2.4卵巢组织TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的表达水平 取保存于液氮中的卵巢组织,提取蛋白,用BCA试剂盒定量、配平。取40 μg卵巢组织蛋白样品加入上样缓冲液,置于100 ℃水浴5 min,离心取上清,恒压下电泳后以湿转法转至硝酸纤维素膜上,加入封闭液封闭2 h,加入兔抗大鼠TGF-β1(1∶400)、Smad4(1∶200)、Smad3和p-Smad3(1∶200)一抗,置于4 ℃摇床上孵育过夜,用TBST充分洗膜,加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000),室温孵育2 h,用TBST充分洗膜,加入ECL显色剂于暗室中曝光,用凝胶成像系统进行分析,以待测蛋白/内参GAPDH灰度值表示蛋白的相对表达量。重复3次取平均值。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况

健康组大鼠皮毛光滑,饮食、活动量正常,对外界刺激警觉。排卵障碍组皮毛稀松、无光泽,进食量、活动量减少,倦怠,体质量无增加甚至减轻,抑制剂组更为严重。白芍总苷组、抑制剂+白芍总苷组干预后症状有所好转,其中白芍总苷组的改善更为明显。

3.2 血清性激素、AMH水平比较

与健康组比较,排卵障碍组血清LH、FSH、E2和AMH的水平均降低;抑制剂组、排卵障碍组、抑制剂+白芍总苷组、白芍总苷组血清LH、FSH、E2和AMH的水平依次升高(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组血清性激素、AMH水平比较

3.3 排卵功能比较

与健康组比较,排卵障碍组成熟卵泡数、生长卵泡数和黄体数减少;抑制剂组、排卵障碍组、抑制剂+白芍总苷组和白芍总苷组成熟卵泡数、生长卵泡数和黄体数依次增加(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组排卵功能比较

3.4 各组卵巢组织形态学变化

健康组可观察到较多始基和差异发育卵泡;排卵障碍组卵巢组织中黄体和差异发育卵泡的数量明显减少,可观察到较多囊状扩张卵泡,卵泡中颗粒细胞层数消失或明显减少;抑制剂组的变化更为明显;抑制剂+白芍总苷组、白芍总苷组始基卵泡、初级卵泡及黄体数量增加,白芍总苷组的改善更为明显。结果见图1。

注:A.健康组;B.排卵障碍组;C.抑制剂组;D.白芍总苷组;E.抑制剂+白芍总苷组。

3.5 排卵障碍组蛋白的表达水平

与健康组比较,排卵障碍组TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的相对表达量降低;抑制剂组、排卵障碍组、抑制剂+白芍总苷组、白芍总苷组TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的相对表达量依次升高(P<0.05)。结果见表3和图3。

表3 各组TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白表达水平比较

图2 Western blot检测TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的表达水平

4 讨论

下丘脑-垂体-卵巢轴是严格控制女性生殖的调控系统,该轴中的任何一个环节发生器质性病变或功能失调,均可引发排卵障碍[8-9]。排卵障碍即为卵泡不能发育成熟或成熟后不能排出,其主要病因包括下丘脑性无排卵、垂体功能障碍、卵巢性无排卵及甲状腺、肾上腺功能失调。中医在女性不孕治疗方面积累了大量经验,肝调畅气机、主疏泄,是冲任二脉阴阳消长转化,卵子发育、成熟且顺利排出的关键枢机[10]。白芍入肝脾血分,在古方与现代组方中通常作为配伍药物参与排卵障碍疾病的治疗。然而,中药组方对排卵障碍的治疗作用是通过多环节、多途径及多靶点来实现的,研究单味药物或中药单体,更有利于中医药有效成分的定性、定量,便于临床推广。因此,本课题组选用白芍总苷,研究其对排卵障碍的治疗作用及可能的机制。

中医认为[11],肾-天葵-冲任-胞宫生殖轴的平衡、协调是调节女子生殖系统的重要枢纽。肾气足、天葵至、冲任通盛,则月经规律,可孕子。肾之开合,不仅与肾阳相关,而且与肝疏泄功能具有密切关系。肝主气机,自古就有学者认为“女子以肝为先天”,肝为刚脏,如肝气郁结、疏泄不利,则无法将肾所产生的成熟卵子规律地疏泄出,导致排卵功能障碍[12]。白芍是常用的养血调经、平抑肝阳的中药,通常用于女性月经不调、经孕带产等病症的治疗。白芍总苷是白芍的药效成分单体,具有镇静,镇痛,抗惊厥,抗炎,调节免疫系统,保护肝脏、肾脏等多种药理活性[13]。随着对中药单体研究的逐渐深入,白芍总苷在生殖系统疾病治疗中的作用逐渐受到关注。现代药理学研究发现[14],白芍总苷可通过调节神经、内分泌、免疫系统提升机体整体机能,并作用于卵巢,影响睾酮与E2合成过程中17-β甾酮氧化还原酶及芳香化酶等的活性,抑制睾酮分解,促进E2合成从而诱发排卵。本研究结果显示,与排卵障碍组比较,白芍总苷组血清LH、FSH、E2、AMH水平升高,成熟卵泡数、生长卵泡数、黄体数增加,卵巢组织中始基卵泡、初级卵泡及黄体数量增加,提示白芍总苷可提高排卵障碍大鼠性激素及AMH水平,改善排卵功能。

卵泡的生长、发育、成熟、排出过程十分复杂,受多种自分泌、旁分泌因子的调控,其中卵巢局部的TGF-β1/Smads通路备受关注,该通路在卵巢分化、演变,以及卵泡发育过程中发挥重要作用。TGF-β1是一种涉及细胞生长、分化及组织修复等过程的多功能细胞因子。有学者提出[15],TGF-β1参与卵巢局部调节,介导E2刺激卵巢颗粒细胞、窦前期卵泡颗粒细胞DNA合成,促进血清雌激素水平升高以改善排卵。Smads蛋白家族是目前唯一被证实的TGF-β1受体作用底物,显著表达于哺乳动物卵巢,同时介导TGF-β超家族在卵泡发育及排卵中的作用[16]。Smad3作为Smads家族中受体调节型蛋白,阶段特定性表达于卵泡颗粒细胞中,通过磷酸化作用发挥生物学效应[17]。Smad4是Smads家族中的通用型蛋白,通过与活化的Smad3形成复合物,转移至细胞核,协同其他转录因子对TGF-β1应答基因转录进行调节[18-19]。本研究中,与排卵障碍组比较,抑制剂组、排卵障碍组、抑制剂+白芍总苷组、白芍总苷组TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的相对表达量依次升高,表明TGF-β1/Smads通路抑制剂的使用可削弱白芍总苷对排卵障碍的治疗作用,且TGF-β1/Smads通路被抑制可能引起排卵障碍,白芍总苷可能通过激活该通路发挥治疗作用。孙玉英等[20]的研究表明,对于卵巢储备功能下降大鼠,上调其卵巢中TGF-β1/Smads通路,可增强卵巢储备功能,改善促排卵效果,本研究的结果与之高度一致。

综上所述,白芍总苷可提高排卵障碍大鼠性激素、AMH水平,改善排卵功能、卵巢组织形态学变化,该作用可能通过激活TGF-β1/Smads通路实现。