基于HPLC多指标含量测定及化学计量学的养正消积胶囊质量评价

关丽文,高鑫磊,杨天明

1.海南省肿瘤医院临床药学部,海口 570100;2.海南省肿瘤防治中心,海口 570100;3.海口市制药厂有限公司质量管理部,海口 570100;4.广东食品药品职业学院中药学院,广州 510520

养正消积胶囊由女贞子、白花蛇舌草、绞股蓝、黄芪、人参等16味中药加工而成,具有健脾益肾、化瘀解毒的功效,适用于不宜手术的脾肾两虚、瘀毒内阴型原发性肝癌的辅助治疗[1],与肝内动脉介入灌注加栓塞化疗合用,有助于提高介入化疗的疗效,减轻对白细胞、肝功能、血红蛋白的毒性作用,提高患者的生存质量,改善脘腹胀满、纳呆食少、神疲乏力、腰膝酸软、溲赤便溏、疼痛等症状[2-4]。该制剂由16味中药配伍,组方颇为复杂,同时每味中药所含药效成分也较复杂,且成分间作用协同。孙悦等[5]对养正消积胶囊的化学成分进行定性分析,共鉴定出20种脂溶性成分和38种水溶性成分。该制剂现行质量标准[6]及相关文献[7]均只对君药女贞子所含齐墩果酸和熊果酸进行定量分析,不能从根本上控制产品的内在质量。多成分或多成分与化学计量学结合的质量控制方法越来越多地应用于对中药及其制剂的质量分析中[8-10]。本实验采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对养正消积胶囊中君药女贞子的主要成分(红景天苷、女贞苷、特女贞苷),臣药绞股蓝的主要代表性成分(绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XVII)及佐药白花蛇舌草的主要活性成分(鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷)的含量进行同时检测,首次建立了养正消积胶囊2种以上成分的质量评价方法,同时用化学计量学方法对10批养正消积胶囊进行聚类分析(cluster analysis,CA)和主成分分析(principal component analysis,PCA),总结养正消积胶囊质量规律,为全面提高该制剂整体质量控制水平提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型HPLC仪(美国安捷伦公司);Venusil XBP C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);QUINTIX35-1CN型十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试药

对照品:红景天苷(批号110818-202009,质量分数98.6%),女贞苷(批号111918-201703,质量分数94.4%),特女贞苷(批号111926-201906,质量分数95.0%)和绞股蓝皂苷XLIX(批号112033-201902,质量分数97.2%)均购自中国食品药品检定研究院;鸡矢藤次苷甲酯(批号PRF8091244,质量分数99.6%),车叶草苷酸(批号PRF9071721,质量分数98.5%),车叶草苷(批号PRF9120743,质量分数99.2%),绞股蓝皂苷A(批号PRF8042023,质量分数99.4%)和绞股蓝皂苷XVII(批号PRF10022525,质量分数99.9%)均购自成都普瑞法科技开发有限公司;乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯。

养正消积胶囊(规格:每粒装0.39 g,批号B1907001、B1908001、B1912001、B1912002、B2009001、B2009002、B2011002、B2103001、B2103002、B2103003,编号依次为S1～S10),购自石家庄以岭药业股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

分别精密称取对照品红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII适量,用体积分数为50%的甲醇制成质量浓度依次为0.302、0.578、0.980、0.178、0.116、0.132、0.410、0.734、0.858 g·L-1的混合对照品储备液。取储备液适量,用体积分数为50%的甲醇稀释20倍得混合对照品溶液(9种成分的质量浓度分别为15.1、28.9、49.0、8.9、5.8、6.6、20.5、36.7、42.9 mg·L-1)。

2.2 供试品溶液的制备

取养正消积胶囊内容物,精密称定0.5 g,精密加入体积分数50%的甲醇25 mL,称定质量,超声处理20 min,放冷补质量,摇匀,过滤,取续滤液得养正消积胶囊供试品溶液。取按养正消积胶囊处方和制法分别制备缺女贞子、缺白花蛇舌草、缺绞股蓝的阴性供试品各适量,再按上述方法制得阴性供试品溶液。

2.3 色谱条件与系统适用性

色谱柱:Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。柱温:30 ℃。流动相:乙腈-2 mL·L-1磷酸溶液。梯度洗脱:0～12 min,15.0%乙腈;12～20 min,15.0%→33.0%乙腈;20～30 min,33.0%→65.0%乙腈;30～50 min,65.0%→78.0%乙腈;50～60 min,78.0%→15.0%乙腈。流速:0.9 mL·min-1。检测波长分别为220 nm(0～21 min检测红景天苷、女贞苷和特女贞苷)[11-13]、238 nm(21～32 min检测鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷)[14-18]和203 nm(32～60 min检测绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII)[19-21]。进样量:10 μL。在该实验条件下,理论板数按所测各成分色谱峰计均>5 500;养正消积胶囊供试品溶液中所测9种成分与相邻色谱峰的分离度>1.5;阴性供试品对养正消积胶囊中各成分的检测无干扰。结果见图1。

注:A.混合对照品;B.养正消积胶囊;C.女贞子阴性供试品;D.白花蛇舌草阴性供试品;E.绞股蓝阴性供试品;1.红景天苷;2.女贞苷;3.特女贞苷;4.鸡矢藤次苷甲酯;5.车叶草苷酸;6.车叶草苷;7.绞股蓝皂苷XLIX;8.绞股蓝皂苷A;9.绞股蓝皂苷XVII。

2.4 方法学考察

2.4.1线性回归 精密吸取2.1项下储备液适量,分别用体积分数50%的甲醇溶液稀释8、10、20、40、100、200倍,摇匀,得一系列混合对照品溶液。精密吸取各混合对照品溶液10 μL,分别注入HPLC仪中,记录峰面积,以红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII峰面积为y轴,以质量浓度为x轴进行线性回归,见表1。结果表明养正消积胶囊中9种成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

表1 线性回归结果

2.4.2精密度、重复性和稳定性实验 精密吸取同一份养正消积胶囊供试品溶液10 μL,注入HPLC仪中,记录色谱峰的峰面积,连续操作6次,测得红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII峰面积的RSD值依次为1.01%、0.86%、0.53%、1.29%、1.34%、1.16%、0.97%、0.62%、0.59%,表明该条件下仪器的精密度良好。

取同一批养正消积胶囊,按照2.2项下方法制备供试品溶液6份,各精密吸取10 μL,注入HPLC仪中,记录色谱峰的峰面积并用外标法计算各成分的含量。计算得9种成分含量的RSD值依次为1.57%、1.36%、1.02%、1.74%、1.85%、1.80%、1.23%、1.15%、1.06%,表明该方法的重复性良好。取同一份养正消积胶囊供试品溶液,分别于0、2、5、9、14、24 h精密吸取10 μL,注入HPLC仪中,记录色谱峰的峰面积,结果显示,养正消积胶囊供试品溶液在24 h内稳定,9种成分峰面积的RSD值依次为0.98%、0.83%、0.59%、1.31%、1.28%、1.20%、1.02%、0.65%、0.58%。

2.4.3加样回收率测定 取已知9种成分含量的同一批养正消积胶囊内容物9份,每份精密称定0.25 g,随机均分成3组,精密加入混合对照品溶液(9种成分的质量浓度分别为0.209、0.435、0.801、0.116、0.079、0.107、0.283、0.514、0.709 g·L-1)0.8、1.0和1.2 mL,再按照2.2项下方法制成加样供试品溶液,各精密吸取10 μL,注入HPLC仪中,记录色谱峰的峰面积,计算得9种成分的平均加样回收率及RSD值。结果见表2。

表2 9种成分的加样回收率实验结果

2.5 含量测定

取养正消积胶囊10批,按照2.2项下方法制备供试品溶液,各精密吸取10 μL,注入HPLC仪中,采用外标法计算各成分的含量。结果见表3。

3 化学计量学质量评价模式的建立

3.1 聚类分析

用SPSS 26.0软件对10批养正消积胶囊进行CA,将表3中的数据导入系统,以9种成分的含量为变量,进行了聚类分析(聚类方法:组间联接;度量区间:Euclidean距离),见图2。结果显示,10批养正消积胶囊供试品聚为3类,S1～S4为第Ⅰ类,S5～S7为第Ⅱ类,S8～S10为第Ⅲ类。

图2 聚类分析结果

表2(续) 9种成分的加样回收率实验结果

表3 含量测定结果 (n=3)

从分类结果可以看出,养正消积胶囊中红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII含量差异与该制剂生产中所用原药材种属、产地以及初加工方法等相关,要求生产企业稳定原药材来源,从源头上保证产品质量和临床疗效。

3.2 主成分分析

将表3中的数据导入SPSS 26.0统计软件,进行PCA分析。结果见表4、表5和图3。由表4可知,前2种主成分的特征值均大于1,分别为6.540、1.130,对方差的贡献率分别为72.668%、12.559%,累计方差贡献率为85.227%,表明选取前2种主成分即可评价养正消积胶囊的质量。由表5可知,红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX和绞股蓝皂苷XVII对第一主成分的影响较大;绞股蓝皂苷A在第二主成分有明显正负荷值。由图3可见,10批养正消积胶囊供试品聚为2类,S1～S4为第Ⅰ类,S5～S7为第Ⅱ类,S8～S10为第Ⅲ类,主成分分析散点图显示的结果与聚类分析的结果一致。

表4 各成分解释的总方差

表5 养正消积胶囊中9种成分含量测定的相关性分析

图3 样品得分图

4 讨论

4.1 检测波长的确定

取2.1项下混合对照品溶液,在200～400 nm范围内进行紫外光谱扫描,结果显示,红景天苷、女贞苷和特女贞苷在220和280 nm附近有较大的吸收值,鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷的最大吸收值出现在230～240nm范围内,绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII呈现末端吸收,综合考虑各成分的检测灵敏度并结合杂质干扰情况,最终选用220 nm检测红景天苷、女贞苷和特女贞苷,238 nm检测鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷,203 nm检测绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII。

4.2 指标性成分的选择

养正消积胶囊由女贞子、白花蛇舌草、绞股蓝、黄芪、人参、灵芝、莪术、炒白术、茯苓、土鳖虫、半枝莲、白英、蛇莓、鸡内金、茵陈和徐长卿加工而成。方中黄芪补气固表,女贞子滋补肝肾,两者共为君药,具有提高免疫的功能;人参大补元气,灵芝补阴益精,绞股蓝清热利湿、解毒消肿,莪术破血行气,以上4味药共为臣药;白术和茯苓补脾益气,半枝莲、白花蛇舌草、白英和蛇莓可以清热解毒、散结消肿、化瘀止血,茵陈清湿热,鸡内金消食健脾,土鳖虫破血逐瘀,以上9味药共为佐药;徐长卿解毒止痛,引药力直达病灶,为其使药。诸药合用,共奏健脾益肾、化瘀解毒之功。为全面评价养正消积胶囊的内在整体质量,本实验选取君药女贞子的主要成分(红景天苷、女贞苷、特女贞苷)臣药绞股蓝的主要代表性成分(绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XVII)及佐药白花蛇舌草的主要活性成分(鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷)作为指标性成分,采用HPLC法,结合化学计量学对其进行分析。

4.3 供试品制备方法的优化

本实验在优化供试品制备方法时,提取方法采用超声和回流提取,提取溶剂选用甲醇[16,19-20]、体积分数为70%的甲醇[11]、体积分数为50%的甲醇[17,21]和稀乙醇[8]。结果显示,用体积分数为50%的甲醇进行超声提取时,养正消积胶囊中各成分含量较高,且背景干扰少。同时,对提取时间(10、20、30、40 min)进行优化,结果显示,提取时间为20 min时,各成分的提取率与提取时间30 min相当,30 min以后,出现较多的杂质干扰。最终选取体积分数为50%的甲醇提取时间20 min为供试品提取方法。

4.4 流动相的优化筛选

本实验在筛选流动相时,分别考察了以乙腈-水[19]、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液[12]、乙腈-1 mL·L-1乙酸溶液[15,18]、乙腈-3 mL·L-1甲酸溶液[16]为流动相时养正消积胶囊中9种成分的分离效果。结果显示,乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液相对于其他3组流动相,分离度好,基线平稳,但在变换波长至203 nm检测绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII时,基线漂移严重,色谱峰不能正常积分。遂对磷酸溶液的浓度进行了探究,同时对比等度洗脱与梯度洗脱,发现将乙腈-2 mL·L-1磷酸溶液作为流动相时,可达到基线分离、各成分响应值大的目的,故选择2.3项下条件对养正消积胶囊中红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII的含量进行同时检测。

本实验建立检测养正消积胶囊中红景天苷、女贞苷、特女贞苷、鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷A和绞股蓝皂苷XVII含量的HPLC法,首次应用聚类分析和主成分分析,对10批养正消积胶囊中9种成分进行降维分析,为多方位评价养正消积胶囊的内在质量提供快捷、有效的方法。