扁吻鱼烂鳃病病原分离鉴定及药敏试验

封永辉，焦 飞，李晓东，韩军军，陈 朋，海萨·艾也力汗

（新疆维吾尔自治区水产科学研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

扁吻鱼（Aspiorhynchus laticeps） 又名新疆大头鱼，属鲤形目鲤科裂腹鱼亚科扁吻鱼属。该鱼是塔里木河盆地动物区系中的旗舰性物种，仅分布于塔里木河水系，是中国新疆独有的鱼类，具有极高的经济和学术研究价值。该鱼曾广泛分布于塔里木河水系的博斯腾湖、罗布泊等地，但因多重因素的影响，目前该鱼的自然种群数量急剧下降，1988 年被列为国家I 类保护水生野生动物，1998 年被收录入《中国濒危动物红皮书（鱼类）》[1]。

目前关于新疆扁吻鱼的研究集中在生态、生物学、资源调查、胚胎发育等方面[2-5]，在扁吻鱼的病害研究方面，只有马燕武等[6]对鱼苗的寄生虫病防治进行初步研究，谢春刚等[7]对扁吻鱼幼鱼进行了7 种药物的急性毒性试验，对细菌性病害的深入研究尚未见报道。在以往开展的扁吻鱼人工繁育试验过程中，经常发生烂鳃引起的鱼类死亡事件，但其体表和内部脏器却正常，笔者从扁吻鱼烂鳃部位及其水体中分离出了5 株菌株，以这5 株菌株为研究对象，进行耐药性试验，以期确定病原菌的耐药性，为扁吻鱼的人工繁育和保种工作提供必要的技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼发病扁吻鱼，鳃丝糜烂，体表及解剖体内重要组织器官未见异常（如图1），采集新疆水生野生动物救护中心发病的扁吻鱼5尾作为试验材料。

图1 发病扁吻鱼

1.1.2 主要试剂培养基RS、TSA、MH、MHA（青岛海博生物有限公司和广州环凯微生物科技有限公司）；药敏纸片多西环素30 μg/片、甲氧苄啶5 μg/片、恩诺沙星10 μg/片、新霉素30 μg/片（杭州天和微生物试剂有限公司）；药敏纸片土霉素30 μg/片、氟苯尼考30 μg/片（上海源叶生物科技有限公司）；PCR、引物及提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；60 mm 一次性平板。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离取刚刚死亡的扁吻鱼5 尾，在无菌环境下取下烂鳃，接种于RS 一次性平板上，置于18℃生化培养箱中培养18～36 h，挑取菌落形态大小、颜色不一样的菌落分别进一步划线纯化，分离纯化后的单菌株用25%的甘油保存于－20℃冰箱中。

1.2.2 病原菌16S rDNA 序列分析病原菌的分子鉴定交由上海海洋大学完成，16S rDNA 序列分析采取通用引物，正向27F：5′-AGAGTTTGATC（C/A）TGGC TCAG-3′，反向1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′。参照常规方法进行PCR 反应扩增目的片段。扩增产物确定为目的片段后送生工生物工程（上海）股份有限公司纯化及测序。

1.2.3 系统发育树构建将扩增的菌株16S rDNA 目的片段序列在NCBI 中比对，根据比对结果检索出同源性较高的序列采用Clustal X 软件进行多序列匹配分析，采用MEGA5.0 软件中的Neighbor-Joining 法构建系统进化树，以1 000 次Bootstrap 检验置信度[8]。

1.2.4 药敏特性研究通过纸片扩散法进行药敏特性相关研究，将分离的菌株接种于MH 培养基，18℃震荡（200 r/min） 24 h 后，调整菌液浓度为2.0×107CFU/mL，取200 μL 菌液均匀涂布在MH、TSA、RS平板上，贴上6 种不同的抗生素纸片，分别在10、20、30℃下培养18～46 h 后用游标卡尺测量不同药物的抑菌圈直径（cm）, 根据表1 判定菌株对抗生素的敏感性[9-11]。

表1 药敏纸片判定标准

2 结果与分析

2.1 优势菌株的菌落形态

从患病扁吻鱼的烂鳃及水样中分离出颜色、菌落形态不同的5 株优势菌进行纯化鉴定，其菌落形态特征详见表2。其中，编号33、36 和38 的菌株是从扁吻鱼鳃中分离纯化的，而编号35 和37 的菌株来源于养殖扁吻鱼的水样。

表2 5 株优势菌株的来源及菌落形态

2.2 优势菌株的生长曲线

从图2 中可以看出，5 株细菌采用MH 培养基在18℃培养时，0～18 h 都处于适应期；编号33 的菌株在22～26 h 处于稳定期，随后进入衰亡期；编号35 的菌株在培养22 h 时最先达到生长高峰，随后OD450值显著降低，培养24～28 h 时OD450值维持在相对稳定的状态，说明菌株生长已经到达稳定期；编号36 的菌株在18 h 进入对数生长期，到26 h 时OD450值达到最大值，随后急剧下降，培养28 h 时，OD450值仅为0.599，可能菌株摇瓶培养时，因各种理化因子影响无稳定期；编号37 的菌株在培养28 h 时，OD450值达到顶峰，随后也是急剧下降，到32 h时OD450值仅为2.769，可能菌株在这期间释放了细胞死亡物质，到达稳定期后，快速进入衰亡期；编号38 的菌株在18～28 h 处于对数生长期，在28～32 h 处于稳定期，随后进入衰亡期。

图2 5 株优势菌株的生长曲线

2.3 菌株的分子鉴定

对5 种优势菌株的16S rDNA 进行PCR 扩增，将目的基因序列与NCBI 基因库中已有序列进行比对，并构建系统发育树，结果如图3 所示，菌株33（序列号：OK287125）、37（序列号：OK287129）、38（序列号：OK287130）与柠檬酸杆菌属（Citrobactersp.），菌株35（序列号：OK287127）、36（序列号：OK287128）与气单胞菌属（Aeromonassp.）种类同源性较高。

图3 五株细菌根据16S rDNA 基因序列构建的系统进化树

2.4 影响优势菌株对抗生素敏感性的因素

2.4.1 培养基由表3 可知，对土霉素敏感的菌株为33 和38，对恩诺沙星敏感的菌株为35、37 和38，对氟苯尼考敏感的菌株为33、35、36 和38，对多西环素敏感的菌株为33 和38，5 种菌株对新霉素和甲氧苄啶均不敏感。6 种抗生素种类、5 株菌株共30 组数据中有11 组数据的结果一致，占比为37%，表明培养基会影响菌株对抗生素的敏感性，且影响较大；从菌株来看，33 号菌株在不同培养基中培养对土霉素、氟苯尼考和多西环素的敏感性一致，35 号菌株在不同培养基中培养对恩诺沙星、氟苯尼考的敏感性一致，36 号菌株在不同培养基中培养对氟苯尼考的敏感性一致，37 号菌株在不同培养基中培养对恩诺沙星的敏感性一致，38 号菌株在不同培养基中培养对土霉素、恩诺沙星、氟苯尼考和多西环素的敏感性一致；从抗生素来看，培养基对氟苯尼考和恩诺沙星的影响较小，5 株菌株中分别有4（占比80%）和3 株（占比60%）的敏感性结果一致，但对新霉素和甲氧苄啶的影响较大，同一菌株在不同培养基中培养对这2 种抗生素的敏感性结果均不一样。

表3 不同培养基培养下各菌株的药敏试验结果

2.4.2 培养时间由表4 可知，培养18～22 和48～46 h 期间，5 株菌株对土霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、甲氧苄啶和多西环素均表现为敏感，而新霉素只对35号菌株作用较强，对33、36、37、38 号菌株有一定抑制作用。从表4 中还可以看出，培养时间对抗生素药物敏感性的结果无明显影响，不同培养时间的同一菌株对同一抗生素的敏感性结果均表现一致。

表4 不同培养时间培养下各菌株的药敏试验结果

2.4.3 培养温度由表5 可知，培养温度对抗生素药物敏感性的结果有一定的影响，除38 号菌株外，其他4 种菌株在10℃下培养对土霉素均未形成抑菌圈。从菌株来看，培养温度对36 和38 号菌株的影响最小，不同温度下培养的36 号菌株对同一抗生素（土霉素除外）的敏感性均表现一致，除新霉素以外不同温度下培养的38 号菌株对其他抗生素均表现敏感；而对33 号菌株影响最大，不同温度下培养的33 号菌株仅对氟苯尼考和多西环素的敏感性一致。从抗生素来看，不同温度下培养的5 种菌株对土霉素、氟苯尼考和多西环素均表现敏感；对恩诺星沙表现敏感的菌株有35、36 和38 号；对甲氧苄啶表现敏感的菌株有36、37 和38 号；而新霉素对36 和37 号菌株表现为抑制作用；其他未提及的处理，菌株对抗生素的敏感性随培养温度变化而表现出一定差异，但总体来看6 种抗生素对5 种菌株均表现出抑制以上的作用。

表5 不同培养温度培养下各菌株的药敏试验结果

3 讨 论

国内的药敏试验多采用人用或兽用药物如青霉素、氨苄西林、复方新诺[12]、庆大霉素、卡那霉素[13]、头孢菌素类[14]、四环素[15]等，也有用水产禁用药物氯霉素、停用药物诺氟沙星[16-17]、氧氟沙星[18]、培氟沙星做基础研究的，很少能有用《水产养殖用药明白纸》中允许使用的抗生素来做基础研究的，该研究采用水产生产实践中常用抗生素作为药敏试验材料，试验结果可以直接指导生产实践，同时探讨了培养基、培养时间、培养温度3 个因素对药敏结果的影响，最终判定，对土霉素敏感的菌株为33 和38 号，对恩诺沙星敏感的菌株为35 和38 号，对氟苯尼考敏感的菌株为33、35、36 和38 号，对多西环素敏感的菌株为33 和38 号，5 个菌株对新霉素和甲氧苄啶均不敏感；培养时间对药敏试验结果的影响较小，而培养基和培养温度对药敏试验结果的影响较大，急需建立水生动物致病生物药物敏感性的基础数据库，包括菌株、药物、区域、培养条件等试验参考标准数据库，以便今后渔业生产应用中避免盲目用药[19]。

该研究采用的对照菌株为E.coli（ATCC25922），但其在10 和20℃时均不生长，只有在30℃下才生长，因此今后还需摸索试验用药敏标准菌株；同时，对水生动物病原菌药敏试验的标准方法也尚待完善。另外，该研究中编号33、36、38 的菌株是否为真正的致病性菌株，也需后续攻毒试验进一步确认。