牛奶中多西环素残留消除及最大残留限量

孔伶俐，林翠萍，陆毅兴，姚雪军，劳华杰，曾东平* (.华南农业大学 兽医学院 广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广东 广州 5064；.华南农业大学 兽医学院 农业农村部畜禽产品质量监督检验测试中心

(广州)，广东 广州 510642)

多西环素(doxycycline)是一种四环素类广谱抗生素，又称脱氧土霉素、强力霉素，体内外抗菌活性优于土霉素和四环素[1]。多西环素内服后吸收迅速，具有生物利用度高、组织渗透力强、体内分布广、半衰期长等特点[2-3]。其对革兰阳性菌、阴性菌、以及支原体等均有抑制作用，近年来亦可用于治疗水生动物疾病，如鱼的弧菌病、爱德华菌病和气单胞菌病等[4-5]。为保障动物性食品安全，我国规定了多西环素在猪、牛、家禽和鱼可食性组织的最大残留限量，其中奶牛泌乳期和家禽产蛋期禁用[6]。

目前我国已批准盐酸多西环素子宫注入剂用于预防奶牛产后感染，治疗由敏感菌引起的子宫内膜炎、子宫蓄脓、子宫炎和宫颈炎等。由于我国不允许多西环素用于泌乳期奶牛，尚未制定牛奶中多西环素最大残留限量，盐酸多西环素子宫注入剂的使用是否对牛奶的安全和人类的健康产生潜在的危害尚未可知。本研究通过查阅和调研粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)、国际食品法典委员会(CAC)及欧洲药品管理局(EMA)等国际性组织和美国等发达国家制定动物性食品中多西环素最大残留限量研究方法，依据我国动物性食品中多西环素最大残留限量的规定，开展盐酸多西环素在牛奶中的残留消除，制定牛奶中多西环素最大残留限量，为牛奶安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂盐酸多西环素子宫注入剂，含量规格：按C22H24N2O8计算24 g∶2 g，批号20191006，购自华秦源(北京)动物药业有限公司；盐酸多西环素对照品(含量85.2%)，批号K0131209，购自中国兽医药品监察所；盐酸多西环素-d3，含量97.0%，批号20191112，购自Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，购自美国Thermo Fisher公司；乙二胺四乙酸二钠，分析纯，购自南京化学试剂有限公司；三氟乙酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙酸乙酯，均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.2 主要仪器设备Agilent1200型高效液相色谱仪，购自6430串联四极杆质谱仪，美国Agilent公司；高速台式冷冻离心机，购自德国Eppendorf公司；氮吹浓缩仪，购自广州飞迪生物科技有限公司；旋涡混合器，购自上海青浦泸西仪器厂；数控超声波清洗器，购自昆山禾创超声仪器有限公司；两用型隔膜真空泵，购自天津市津腾实验设备有限公司；Oasis HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL。

1.3 实验动物健康成年荷斯坦奶牛20头，高产和低产奶牛各10头，由内蒙古自治区兴安盟乌兰浩特市某牧场提供。试验前不给予任何药物，采用散栏饲养方式，主要饲喂干草粗饲，每日饲喂2次，自由饮水，临床观察1周。

1.4 牛奶中多西环素残留消除

1.4.1给药与样品采集 产后的奶牛给药前用3%的新洁尔灭溶液冲洗肛门部及外阴周围，然后用75%酒精棉球对阴道边缘及内侧进行消毒，根据临床推荐给药剂量和给药时间，采用给药1次，1支/次。给药前采集空白牛奶，停药后分别于6，12，24，48，72，96，120，144和168 h清洗乳区，对奶头进行消毒，挤净每头奶牛4个乳区的奶，并置于同一容器内使成为混合奶，从中取100 mL于聚丙烯瓶中，密封，做好标记，-20℃保存。

1.4.2样品前处理 参考国家标准的方法并做修改[7]。称取(5±0.01) g试样于50 mL聚丙烯离心管中，用0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲液溶解并定容至40 mL，涡旋混合1 min，冰水浴超声10 min，转移至50 mL聚丙烯离心管中，冷却至0～4℃，5 000 r/min离心10 min，用快速滤纸过滤，待净化。

准确吸取4 mL提取液以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇水淋洗，弃去全部流出液，2.0 kPa以下减压抽干5 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯洗脱。40℃下将洗脱液氮吹浓缩至干，用1.0 mL 10%甲醇+三氟乙酸溶液溶解残渣，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4.3液相色谱条件 色谱柱为C8柱(150 mm ×2.1 mm，粒径5 μm，美国Phenomenex公司)；流动相：A：0.01 mol/L三氟乙酸溶液；B：甲醇；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；柱温：26℃；进样体积：5 μL。

表1 流动相梯度洗脱梯度

1.4.4质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)，正离子扫描，多反应监测，毛细管电压：4 000 V，雾化气流速：9 L/min，雾化气温度：350℃，多西环素和多西环素-d3的主要参考质谱参数见表2。

表2 多西环素和多西环素-d3的质谱参数

1.4.5基质标准曲线的制备 空白牛奶按照1.4.2的方法处理，制得到空白牛奶基质溶液，准确量取多西环素和多西环素-d3标准工作液适量，分别用空白基质溶液配制成多西环素浓度为2.5,5.0,12.5,25.0,50.0,125.0和250.0 μg/L，多西环素-d3浓度均为25.0 μg/L的系列基质匹配标准溶液，临用现配，供LC-MS/MS测定。

1.4.6检测限和定量限的测定 取空白牛奶添加不同浓度多西环素标准工作液，配制成一系列低浓度空白添加样品，按上述样品处理的方法处理。以信噪比(S/N)≥3时所对应的添加浓度为检测限(LOD)，S/N≥10时所对应的添加浓度为定量限(LOQ)。

1.4.7回收率和变异系数的测定 取空白牛奶样品加入多西环素标准工作液和多西环素-d3工作液，制备5，10和20 μg/kg 3个浓度的空白牛奶添加样品。按照1.4.2、1.4.3、1.4.4的样品分析方法进行处理，并经仪器检测，每个浓度设6个重复，连续重复3批，采用单点定量法，计算不同添加浓度下的回收率、批内精密度和批间精密度。

1.4.8样品测定 每头奶牛每个时间点的奶样都进行2个平行处理，结果以两者平均值表示，同时设置空白牛奶和空白添加药物进行对照，记录药物和内标的峰面积，带入标准曲线回归方程计算牛奶中盐酸多西环素的残留量。

1.4.9数据分析 每头奶牛每个时间点取2个平行样检测结果的平均值作为最终检测结果，使用WTM1.4软件，计算弃奶期。

1.5 牛奶中多西环素残留最大残留限量

1.5.1每日允许摄入量 欧盟和我国规定多西环素的ADI为0～3 μg/kg，1个体质量60 kg的人每日允许摄入量为180 μg。

1.5.2残留标示物 欧盟和我国规定动物性组织中多西环素的残留标示物为多西环素，牛奶中多西环素残留标识物与总残留的比值为1。

1.5.3最大残留限量 我国和欧盟制定了多西环素最大残留限量，牛(泌乳期禁用)，肌肉100 μg/kg，脂肪300 μg/kg，肝脏300 μg/kg，肾脏600 μg/kg；猪，肌肉100 μg/kg，皮+脂300 μg/kg，肝脏300 μg/kg，肾脏600 μg/kg；家禽，肌肉100 μg/kg，皮+脂300 μg/kg，肝脏300 μg/kg。

1.5.4理论最大日摄入量 欧盟要求不同动物品种的理论最大日摄入量(TMDI)不得超过ADI。欧盟EMA规定1个体质量60 kg的人每日食物消费系数为：肌肉300 g，肝脏100 g，肾脏50 g，脂肪50 g，奶1 500 g，鸡蛋100 g，蜂蜜50 g。按照欧盟EMA理论最大日摄入量计算，肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中多西环素的每日摄入量分别为30，15，30和30 μg，总计为105 μg，占多西环素ADI的58%。

1.5.5MRL的外推 基于上述基础，采用EMA建议的MRL外推方法制定牛奶中多西环素最大残留限量。肌肉、肝脏、脂肪和肾脏可食性组织中多西环素的理论最大日摄入量相当于ADI的58%。考虑到四环素类其他药物已批准用于奶牛、蛋鸡和鱼，因此，将多西环素剩余ADI的42%用于制定牛奶、蛋和鱼中的最大残留限量并计算理论最大日摄入量。

2 结果

2.1 牛奶中多西环素残留消除

2.1.1色谱分离 空白牛奶按1.4.2方法处理后将空白牛奶基质和空白牛奶基质加入一定浓度多西环素标准工作液和多西环素-d3溶液的样品进行液相色谱-串联质谱分析，多西环素标准溶液、空白牛奶、空白牛奶提取液添加多西环素及多西环素-d3工作溶液的特征离子质量色谱图见图1～3。由图可知，空白样品中无干扰峰，药物的出峰时间为17.9 min左右。

图1 多西环素标准溶液(0.05 mg/L)多反应监测色谱图

图2 空白牛奶基质和空白牛奶基质添加多西环素-d3(50 μg/kg)多反应监测色谱图

图3 空白牛奶基质添加多西环素(50 μg/kg)和多西环素-d3(50 μg/kg)多反应监测色谱图

2.1.2标准曲线和线性范围 多西环素在牛奶中的线性范围为5～500 μg/kg，线性方程和相关系数如表3所示。

表3 标准曲线回归方程与相关系数

2.1.3检测限和定量限 按信噪比(S/N)≥3为检测限(LOD)，S/N≥10为定量限(LOQ)。求得方法在牛奶中的检测限为2.5 μg/kg，定量限为5 μg/kg。

2.1.4回收率和变异系数 多西环素在牛奶的回收率以及批内、批间变异系数见表4。在5,10和20 μg/kg 3个添加浓度的回收率为86.7%～95.9%，批内、批间相对标准偏差分别小于7.1%,5.5%。

表4 空白牛奶中添加多西环素的回收率和变异系数(n=6)

2.1.5牛奶中多西环素残留消除 各时间点牛奶中多西环素残留量如表5所示。停药后6,12,24,48,72 h，20头奶牛的牛奶样品均检测出多西环素，药物浓度在8～270 μg/kg。停药后96 h，18头奶牛的牛奶样品检测出多西环素，药物浓度在6～71 μg/kg。停药后120 h，14头奶牛的牛奶样品检测出多西环素，药物浓度在6～25 μg/kg。停药后144 h，9头奶牛的牛奶样品检测出多西环素，药物浓度为6～25 μg/kg。停药后168 h后，仅1头奶牛的牛奶样品检测出多西环素，质量浓度为9 mg/L。

表5 停药后不同时间牛奶样品中多西环素的浓度 μg/kg

2.2 牛奶中多西环素最大残留限量制定

2.2.1MRL的外推 对于已建立ADI的兽药，如果药物的代谢与已知在有关动物的代谢行为类似，则将ADI值按比例分配到全部组织+蛋/奶，根据WHO推荐的食物消费系数，推导出各种组织和蛋/奶的MRL。如果药物的代谢与已知动物的代谢特征不同，则应进行靶动物残留标示物消除试验后建立MRL。多西环素已确定ADI，且其药物的代谢与已知在有关动物的代谢行为类似，所以多西环素的最大残留限量按照前者进行计算。

按照欧盟EMA理论最大日摄入量计算，肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中多西环素的每日摄入量分别为30，15，30和30 μg，总计为105 μg(相当于每日摄入量的58%)，剩余75 μg(相当于每日摄入量的42%)，用于制定牛奶、鸡蛋和蜂蜜中的最大残留限量。由于EMA显示每位消费者每日的牛奶消耗量为1 500 g，考虑到牛奶中标志物占总残留量的比率为1，建议牛奶中多西环素最大残留限量为10 μg/kg，其每日摄入量为15 μg，人体日摄入总量为120 μg，占每日摄入量的67%。结果见表6。

表6 多西环素理论最大日摄入量

2.2.2盐酸多西环素子宫注入剂在奶牛的休药期 使用软件WTM1.4，选取20头奶牛的停药后12,24,48,72,96,120,144和168 h共8个时间点进行计算，结果显示WT值为206，建议弃奶期为9 d。

3 讨论

3.1 牛奶中多西环素残留消除国内外关于多西环素在猪、鸡和鱼的残留相关研究已有不少报道[8-10]，但在奶牛的研究较少。本研究开展的盐酸多西环素子宫注入剂在牛奶中残留消除试验表明，在停药后12 h，多西环素在牛奶中的药物浓度最高，可达270 μg/kg，停药后144 h，9头奶牛的牛奶样品检测出多西环素，药物浓度为6～25 μg/kg。停药后168 h后，仅1头奶牛的牛奶样品检测出多西环素，质量浓度为9 mg/L。这比文献报道的多西环素在猪、鸡等可食性组织的浓度低，残留消除快，其可能的原因是该制剂经子宫给药，主要用于局部治疗，全身吸收较少[11-13]。

3.2 牛奶中多西环素最大残留限量目前，国外已有关于已制定牛可食性组织最大残留限量的兽药外推制定牛奶最大残留限量的研究报道。EMA报道了硝碘酚腈、三氯苯达唑、氯舒隆、碘醚柳胺在牛奶中最大残留限量的评估报告[14-17]。本研究参考上述方法制定多西环素在牛奶中的最大残留限量。多西环素的微生物学ADI为3 μg/kg(即180 μg/人)。我国已经规定多西环素在牛可食性组织中的MRL，肌肉100 μg/kg，脂肪300 μg/kg，肝脏300 μg/kg，肾脏600 μg/kg，占ADI的58%。多西环素的残留标示物与总残留的比值为1。本研究没有将剩余42%的ADI用于奶中最大残留限量的制定，考虑到多西环素可能批准用于蛋鸡和蜜蜂，所以建议牛奶中多西环素的最大残留限量为10 μg/kg(加上可食性组织相当于ADI的67%)，剩余33%的ADI可用于鸡蛋和蜂蜜中最大残留限量的制定。

3.3 盐酸多西环素子宫注入剂在牛奶中的弃奶期本研究采用EMA推荐的WTM1.4弃奶期计算软件，以95%可信限为标准，计算盐酸多西环素子宫注入剂在牛奶中的弃奶期。结果表明，盐酸多西环素子宫注入剂在牛奶中的弃奶期为9 d。我国批准盐酸多西环素子宫注入剂的休药期，牛28 d，弃奶期7 d。本研究计算的弃奶期与我国批准的盐酸多西环素子宫注入剂较一致。

综上所述，建议参照欧盟多西环素牛可食性食品中最大残留限量外推到牛奶中最大残留限量方法，将每日允许摄入量按比例分配到全部组织+奶，推荐牛奶中多西环素的最大残留限量为10 μg/kg，采用WTM 1.4 软件计算盐酸多西环素子宫注入剂在牛奶中残留弃奶期为9 d。