全外显子测序技术检测一家系先天性手指屈曲畸形基因突变

严争， 陈珊， 刘凡， 陈俊， 黄青兰， 陈晓婷

先天性手指屈曲畸形是一种常见的先天性手指畸形，由几种组织发育不良所致，包括掌面皮肤不足、指浅屈肌腱短缩、指伸腱结构松弛发育不全、蚓状肌错位附着、侧副韧带及掌板短缩等[1]。流行病学统计数据显示[2]，目前我国先天性手部畸形的发病率为1/2 000，男性显著高于女性，以先天性手指屈曲畸形占比较大，不仅严重影响患儿手功能的发挥，而且对患儿的生理和心理发育也有较大影响。患者确诊后即需采取按摩、支具伸直位固定、手术矫正、功能训练以及心理治疗等，给患者个人及其家庭增加了严重的经济负担和心理压力[3]。

目前，先天性手指屈曲畸形已被证明显示出常染色体显性遗传模式，即指缺陷基因呈显性表达，50%的子女均可能发病[4-5]。本研究通过高通量测序技术对我国一个先天性手指屈曲畸形家系的先证者及其父亲、母亲、爷爷进行全外显子测序，并进行拷贝数变异(copy number variation, CNV)分析，根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)遗传变异分类标准与指南对测序结果进行解读，发现FBN2基因上一个突变位点(c.3398A>G)，该突变未被报道，可能是先天性手指屈曲畸形的致病原因，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 先证者，男，5岁，临床表现为手部骨骼异常，手指不能伸展，手指可直向活动、可握拳，出生时即表现为手指屈伸畸形。查体显示智力正常，未见其他组织器官异常。家族史显示，先证者的父亲、爷爷均表现为手指屈曲畸形。本研究经福州市第一医院伦理委员会批准，受检者均知情同意。

1.2 DNA提取和全外显子测序 对先证者及其父亲、母亲和爷爷进行遗传咨询，绘制家族遗传图谱。采集先证者及其家属3代共计4人的外周血，使用全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA。对外周血DNA进行基于illumina二代测序平台，采用Agilent SureSelectXTHuman All Exon V6 kit进行捕获建库，利用双末端(150 bp X 2)测序的方法，完成临床样本的全外显子组测序。

1.3 生物信息学分析 全外显子组测序结果参考dbSNP、ClinVar、OMIM、NCBI、MalaCards、UCSC Genome Browser和DECIPHER数据库，以及北京贝康医学检验所提供的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)芯片进行CNV分析，去除位于内含子中的突变、同义突变以及频率≥0.01的变异位点，优先对先天性手指屈曲畸形相关已知致病基因进行变异位点分析，并结合已发表文献对筛选出的基因进行致病性分析。

2 结 果

2.1 家系遗传分析 先证者家族3代共计4人的家系遗传图谱见图1，表现为常染色体显性遗传特性。先天性手指屈曲畸形在先证者家族中垂直传递，每代家族成员均患病。先证者临床表现为手部骨骼异常，双手手指不能完全伸展(图2A)，其父亲(图2B)和爷爷(图2C)均有类似临床表现。3例均未发现其他疾病。

2.2 全外显子测序质量控制 先证者外周血样本测序的平均覆盖深度为122.61X，大于10X覆盖区域占97.43%，大于20X覆盖区域占93.82%；先证者母亲外周血样本测序的平均覆盖深度为136.88X，大于10X覆盖区域占97.46%，大于20X覆盖区域占94.40%；先证者父亲外周血样本测序的平均覆盖深度为100.84X，大于10X覆盖区域占96.65%，大于20X覆盖区域占91.82%；先证者爷爷外周血样本测序的平均覆盖深度为121.34X，大于10X覆盖区域占97.39%，大于20X覆盖区域占93.69%。

方形为男性，圆形为女性，黑色为先天性手指屈曲畸形，五角星表明已经获取其外周血临床样本进行全外显子组测序。图1 先证者家系遗传图谱Fig.1 Genetic map of the proband’s family

A：先证者；B：先证者父亲；C：先证者爷爷。图2 先证者及其父亲、爷爷手部图Fig.2 Hand images of the proband and his father and grandfather

2.3 全外显子测序结果 本研究对高通量测序结果进行CNV分析，数据分析以GRCh37(hg19)基因组版本为依据，结果显示：先证者FBN2基因26号外显子存在一个遗传自父亲的杂合突变c.3398A>G(p.N1133S)，为错义突变，先证者爷爷也携带该变异。该变异在正常参考人群基因数据库未见报道；计算机辅助分析预测该变异影响蛋白质结构或功能可能性较大。依据ACMG遗传变异分类标准与指南对检出变异进行解读。结果检出FBN2基因26号外显子上存在一个杂合突变：NM_001999 (FBN2): c.3398A>G(p.N1133S)(表1，图3)，遗传自父亲。该突变可能导致FBN2蛋白第288位氨基酸由精氨酸变为半胱氨酸。在千人基因组数据库、ESP6500数据库、Exome Aggregation Consortium(ExAC)数据库和ClinVar数据库中均不存在这种错义突变。经生物信息学软件预测：该基因突变为有害(SIFT: Damaging; Polyphen 2_HDIV: possibly damaging; Polyphen2_HVAR: possibly damaging; Mutation taster: disease_causing)，蛋白结构预测可能有害(Polyphen2, SIFT, Mutation taster)，软件预测该核苷酸具有高度保守性(GERP, phyloP, phastCons)。依据ACMG遗传变异分类标准与指南，判定该变异为可能致病性变异，其致病证据等级为PM2+PP1+PP3。

表1 全外显子测序结果与解读

图3 FBN2基因c.3398A>G变异的测序结果Fig.3 Sequencing results of c.3398A>G variant in FBN2 gene

3 讨 论

先天性手指屈曲畸形是一种常染色体显性遗传性疾病，以食指、中指和小指单独或多个手指关节无法正常伸展为主要临床表现[4-5]。先天性手指屈曲畸形可分为3类，即婴幼儿期手指屈曲畸形(男女发病率相似)、青春期手指屈曲畸形(女性多发)以及先天性畸形综合征伴手指屈曲畸形(最常见)[6-7]。本研究报道的一家系3代3例先天性手指屈曲畸形均为婴幼儿期手指屈曲畸形，先证者为5周岁的男童，其父亲和爷爷均患有先天性手指屈曲畸形，3例患者均未见其他组织器官障碍，符合先天性手指屈曲畸形常染色体显性遗传特征。

本研究对先证者及其父亲、母亲、爷爷进行外周血DNA全外显子测序，结果发现，先证者FBN2基因26号外显子存在一个遗传自父亲的杂合突变c.3398A>G(p.N1133S)，为错义突变，先证者爷爷也携带该变异。FBN2的全称是原纤维蛋白2，包含具有5个不同结构区域的多域蛋白[8-9]；最大的一个结构区域包含41个钙结合表皮生长因子 (cbEGF)样结构域，每个cbEGF样结构域的天然蛋白质折叠均由6个保守的半胱氨酸残基组成，它们形成3个二硫键以维持蛋白质稳定性[10-11]。目前人类基因突变数据库已报告的120种FBN2基因突变均聚集在这个区域，特别是位于外显子22～36[12-13]。本研究报道的FBN2基因突变即位于FBN2基因的26号外显子(c.3398A>G)。

FBN2突变应该是通过改变关键结合位点(半胱氨酸)、删除整个cbEGF样结构域，或通过在cbEGF样结构域中插入新的糖基化位点，从而改变中心结构域结构[12-13]。目前在FBN2中发现的大多数突变都位于重复序列区域，而本研究新报道的FBN2 c.3398A>G(p.N1133S)突变同样位于重复序列区域。之前关于FBN2突变的报道以先天性挛缩性蛛网膜炎为主，并且FBN2基因是唯一已知与先天性挛缩性蛛网膜炎发病有关的基因[14]。先天性挛缩性蛛网膜炎也称为Beals综合征，是一种常染色体显性遗传的结缔组织疾病，其临床特征是多处屈曲挛缩、蛛网膜下裂、严重的脊柱后侧凸、耳廓异常和肌肉发育不全[15]。LIU等[16]报道过一家系cbEGF功能域中的杂合错义变体，其在FBN2 cbEGF域中产生折叠不稳定性，从而引发先天性挛缩性蛛网膜炎症状，导致该家系3代人均存在不同程度的手指屈曲畸形。此外，YOU等[17]也报道一家系FBN2外显子32的第4 216位核苷酸处存在杂合T → C颠换，导致该家系3代人均出现先天性挛缩性蛛网膜炎症状，但与本研究报道的家系不同的是，该家系同时存在手指屈曲畸形和足部骨骼异常。与之前的FBN2突变引起的先天性挛缩性蛛网膜炎综合表型不同，本研究FBN2突变患者并未表现出先天性挛缩性蛛网膜炎的其他表型，比如心血管或其他神经肌肉异常，原因可能如下：FBN2基因的突变可根据受影响的残基分为3类，而影响钙结合共有序列中残基的突变可能会降低钙结合亲和力，导致结构不稳定。本研究中，p.N1133S 取代破坏了主链的转向，使剩余的Ca2+配体能够占据配位位置和 Gly1145-Phe1143 之间的氢键，这有助于稳定带负电荷的氧原子之间的不利接近，从而可能削弱钙结合亲和力，影响患者的骨骼发育。

总之，本研究报道了一个中国人群中先天性手指屈曲畸形家系，该家系3代人中有3例男性患病，呈现常染色体显性遗传特征。对先证者进行外周血DNA全外显子测序筛查出FBN2 c.3398A>G(p.N1133S)突变，先证者父亲和爷爷均携带该突变，故该突变被认为是本家系先天性手指屈曲畸形发病的主要分子基础。