奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P82的分离及特性研究

党瑞莹，常军帅,梁 晏，屈勇刚，李彦芳，程璐璐，刘若彤，杨盛源,王紫阳，张小玉，赵 玉，周海琴，谢枋得

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832003；2.动物疾病防控兵团重点实验室，石河子 832003)

奶牛乳腺炎是阻碍奶牛业发展最常见的疾病之一，据统计，全球约有30%的奶牛患有此病[1]。该病由病原微生物引发的比例高达85%[2]，其中以细菌占比最高。金黄色葡萄球菌是一种能侵染奶牛乳腺并引发奶牛乳腺炎的细菌，在由细菌作为主要病原微生物的病例中占据一定比例[3]，其传统的治疗药物是抗生素，但由于抗生素的长期使用，致病菌株逐渐对抗生素产生耐药性，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和抗万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycinresistantS.aureus，VRSA)等耐药菌株越来越多，给该病治疗带来极大困难[4-6]。因此，寻找可代替抗生素治疗的制剂更为重要。

噬菌体作为细菌的天然杀手，以一种非传统的抗菌剂形式而备受关注。Capparelli等[7]用感染金黄色葡萄球菌的小鼠作为动物模型进行噬菌体治疗试验，其治愈率高达97%。李陇平[8]采用噬菌体乳头药浴试验对患乳腺炎的奶牛进行治疗，结果表明治疗组奶牛乳区发病率降低了1.97%。本研究以实验室分离出的奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌82为宿主菌，按照裂解性噬菌体的分离方法，分离纯化裂解性噬菌体，并对其物理和生物化学特性、抑菌能力等进行初步研究，以期筛选出噬菌谱宽、效价高、裂解能力强的金黄色葡萄球菌噬菌体候选株，用于制备噬菌体“鸡尾酒”制剂防治奶牛乳腺炎。

1 材料与方法

1.1 菌株及样品来源

试验所用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、粪肠球菌均由石河子大学动物科技学院传染病实验室分离鉴定，主要分离于患乳腺炎奶牛的乳汁样品。采集石河子某奶牛场的污水、挤奶厅的弃奶和粪便并将其混合,作为分离噬菌体的来源。

1.2 主要试剂及仪器

BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司；琼脂粉、PEG8000、2%磷钨酸负染液均购自北京索莱宝科技有限公司；病毒基因 DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DNaseⅠ、RNase A和Mung Bean Nuclease 均购自康为世纪生物科技有限公司；SM缓冲液购自上海源叶生物科技有限公司。

MultifugeXLR台式冷冻离心机购自赛默飞世尔科技有限公司；IS-RDV1立式恒温振荡器购自精骐有限公司；智能电热恒温水浴锅购自北京永光明医疗仪器厂；HT7700透射电子显微镜购自日立(中国)有限公司。

1.3 噬菌体富集

将在奶牛场采集的污水、奶厅的弃奶和粪便样品混合，用玻璃搅拌器搅拌均匀，用折叠4层的纱布过滤，将滤好的液体加到适量的BHI液体培养基中。将金黄色葡萄球菌82的菌液培养至对数期，取200 μL滴加到上述BHI液体培养基。37 ℃恒温摇床180 r/min培养6 h，将样品置于4 ℃离心机中12 000 r/min离心10 min，收集上清，用0.22 μm滤器过滤除菌，滤液即为噬菌体悬液，于4 ℃保存备用。

1.4 噬菌体分离与纯化

参考张玉宇等[9]，采用点滴法及双层琼脂平板法分离纯化噬菌体。用灭菌棉签蘸取过夜培养的金黄色葡萄球菌82菌液均匀涂布于BHI琼脂平板表面，吸取2.5 μL噬菌体悬液滴在上述BHI琼脂平板中央，置于37 ℃恒温培养，待出现肉眼可见的溶菌空斑时，用无菌枪头挑取单个透亮的噬菌斑，用双层琼脂平板法进行噬菌体的纯化，直至观察到形态一致和大小均一的噬菌斑。

1.5 噬菌体浓缩与电镜观察

参考文献韩传银[10]，采用PEG8000对噬菌体进行浓缩。吸取100 μL浓缩后的噬菌体液滴加到铜网上，吸附5 min，用滤纸吸收残余液体，置铜网于2%磷钨酸染液中染色3 min，取出铜网，待自然干燥，通过透射电子显微镜观察其形态。

1.6 噬菌体基因组分析

采用柱提法提取噬菌体基因组，取3份10 μL的噬菌体基因组，分别加入DNaseⅠ、RNase A和Mung Bean Nuclease酶各1 μL，37 ℃处理1 h处理后的样品加入适量Loading Buffer，用 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定其核酸类型。

1.7 噬菌体生物学特性分析

1.7.1 噬菌体效价测定 用BHI液体培养基将已纯化的噬菌体液进行10倍倍比稀释。不同稀释度的噬菌体液各取100 μL，再各加100 μL宿主菌液(1×108CFU/mL)，轻摇混匀后静置吸附10 min，运用双层琼脂平板法进行培养。 选噬菌斑数量在30～300的平板(直径为 90 mm)进行计数。试验重复3次，噬菌体效价依据以下公式进行计算：

噬菌体效价(PFU/mL)=平板上的密度适当的噬菌斑数平均值×稀释倍数×10

1.7.2 噬菌体裂解谱测定 取培养至对数期的63株金黄色葡萄球菌、5株大肠杆菌、4株链球菌、4株粪肠球菌的菌液均匀涂布于BHI固体平板上，取109PFU/mL的噬菌体液 5 μL 点样于涂满菌液的 BHI平板上，平板晾干后37 ℃恒温培养，观察裂解效果。

1.7.3 噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定 参考Heo等[11]方法略有改进，将宿主菌培养至对数生长期后，按照不同MOI(0.0001、0.001、0.001、0.01、0.1、1、10和100)加入相应的噬菌体液并混匀，静置吸附10 min，再加入适量BHI液体培养基，使总体积至5 mL。在37 ℃、180 r/min恒温摇床中培养4 h，采用双层琼脂平板法测定不同MOI的噬菌体效价。 试验反复进行3次，取平均值。

1.7.4 一步生长曲线的测定 将处于对数期的宿主菌与噬菌体按照测定好的最适MOI加入试管中，再加入适量的液体BHI,静置10 min后于37 ℃、180 r/min的恒温振荡器中培养，分别在不同时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、110、130、150、170、190、210、230 min)取5 mL培养液，将混合培养液离心，测定各时段的噬菌体效价，试验反复进行3次，计算平均值绘制噬菌体的一步生长曲线图。

1.7.5 热稳定性测定 取等体积的109PFU/mL的噬菌体液加到无菌离心管内，依次进行不同温度(40、50、60、70和80 ℃)的恒温水浴，各组分别在20、40和60 min时取样，再放入4 ℃冰箱中平衡温度，测定噬菌体效价。该试验反复进行3次，计算平均值绘制热稳定性曲线。

1.7.6 pH稳定性测定 吸取100 μL噬菌体置于1.5 mL EP管里，再加入900 μL已调节pH为2.0～13.0的BHI培养基中10倍稀释。将其混匀后，37 ℃恒温孵育，分别在1、2和3 h取样，以双层琼脂平板法测定不同组的噬菌体效价。试验反复进行3次，计算平均值绘制pH稳定性柱状图。

2 结 果

2.1 噬菌体的纯化及电镜观察

用双层琼脂平板法获得1株噬菌体，对其进行反复纯化，得到纯化后的噬菌体，噬菌斑边缘整齐，均一透亮，直径为1～2 mm(图1)。

在电镜下，获得的噬菌体头部呈二十面体，大小约120 nm×83 nm，有一条带伸缩尾鞘的长尾，尾部的尾丝和尾针明显，长约126 nm，符合有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科的形态特征(图2)。根据《病毒分类—国际病毒分类委员会第9次报告》[12]中对噬菌体分类与命名，将其命名为 vB_SMC_P82(简称P82)。

2.2 噬菌体P82的核酸类型

噬菌体P82的核酸经DNase Ⅰ、RNase A、Mung Bean Nuclease分别处理后，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,由图3可知，DNase Ⅰ可消除噬菌体P82的核酸,而RNase A、Mung Bean Nuclease不能将其消化,可判定其核酸类型为双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)。

2.3 噬菌体P82的生物学特性

2.3.1 噬菌体P82效价 通过双层平板琼脂法测定可知，该噬菌体效价为1.58×109PFU/mL。

2.3.2 噬菌体P82裂解谱 由表1可知，噬菌体P82对63株奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌中的23株有裂解作用，裂解率为36.51%；其中对MRSA类菌株的裂解率为45.95%(17/37)；对VRSA类菌株的裂解率为23.08%(6/26)。说明该噬菌体有较宽的裂解谱。噬菌体P82对5株大肠杆菌、4株链球菌、4株粪肠球菌均未发现有裂解现象。

2.3.3 噬菌体P82最佳MOI 由图4可知，当MOI为100时，噬菌体P82效价最低，当MOI为0.001时，噬菌体P82效价最高，约为2.3×1010PFU/mL。因此，该噬菌体的最佳MOI为 0.001。

图1 噬菌斑形态Fig.1 Plaques morphology

图2 噬菌体透射电镜观察(60 000×)Fig.2 TEM observation of the phage (60 000×)

M,DL15000 DNA Marker;1,噬菌体P82核酸;2～4,噬菌体P82核酸分别经 DNase Ⅰ、RNase A和Mung Bean Nuclease处理M,DL15000 DNA Marker;1,Nucleic acid of phage P42;2-4,Nucleic acid of P82 treated with DNase Ⅰ,RNase A and Mung Bean Nuclease，respectively图3 噬菌体P82核酸类型鉴定Fig.3 Identification of nucleic acid type of phage P82

表1 噬菌体P82的裂菌谱

续表

图4 噬菌体P82最佳MOI的测定Fig.4 Determination of optimal MOI for phage P82

2.3.4 噬菌体P82一步生长曲线 由图5可知，噬菌体P82感染宿主菌后的25 min内效价无明显变化，判定其潜伏期约为25 min。在25～70 min内，噬菌体效价一直保持升高态势，随后趋于稳定，可判定该噬菌体P82的爆发期约为45 min，裂解量约为74 PFU/cell。

2.3.5 噬菌体P82热稳定性 由图6可知，在 40～50 ℃作用 1 h 后，噬菌体P82的效价几乎无变化，活性基本不受影响；噬菌体P82效价拐点约在60 ℃，此时出现下降趋势；噬菌体P82在80 ℃作用40 min后完全丧失活性。

2.3.6 不同pH对噬菌体P82活性的影响 不同pH对噬菌体活性的影响结果显示，在pH 2.0和13.0时噬菌体P82完全丧失活性； 在pH 4.0～12.0范围内，噬菌体P82效价与初始效价无显著性差异(图7)。可判定噬菌体P82具有较广的pH适应范围。

图5 噬菌体P82一步生长曲线Fig.5 One-step growth curve of phage P82

图6 噬菌体P82热稳定性Fig.6 Thermal stability of phage P82

图7 不同 pH 对噬菌体P82活性的影响Fig.7 Influence of different pH on activity of phage P82

3 讨 论

MRSA 和 VRSA 菌株等金黄色葡萄球菌耐药变异株的增多使金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎的治疗难度增加。目前噬菌体被视为一种新型的生物抗菌剂。国内外许多学者已在金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性、全基因组、食品抗菌、疾病治疗等方面进行了相关研究[13-15]。

本研究以患乳腺炎的奶牛乳汁中分离的金黄色葡萄球菌为宿主，分离到1株烈解性噬菌体P82，通过电镜观察发现噬菌体P82属于有尾噬菌体目中的肌尾噬菌体科，与范锦戴等[16]、张志宏等[17]、涂尊方等[18]和鞠磊等[19]分离的噬菌体属于同一个科。噬菌体P82在宿主菌上的最佳 MOI 为 0.001，效价可达到1010PFU/mL。与范锦戴等[16]和张志宏等[17]分离的金黄色葡萄球菌噬菌体相比，噬菌体P82的裂解能力更强，在相同时间和条件下，可更快收获高效价的噬菌体P82悬液，这为将来大量制备噬菌体奠定了基础。宿主谱测定结果表明，噬菌体P82对奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌裂解率为36.51%(23/63)，且对MRSA类菌株裂解率较高(45.95%)，比涂尊方等[18]分离出的金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱更广。本试验对噬菌体P82进行了理化特性和生物学特性的初步分析，结果表明，该噬菌体在60 ℃以下，pH 4.0～12.0范围内较稳定。噬菌体P82的高温耐受能力明显强于Li等[20]和Kraushaar等[21]发现的金黄色葡萄球菌噬菌体，对pH的耐受能力强于陈冈等[22]报道的金黄色葡萄球菌噬菌体(pH 5.0～9.0范围内稳定)。噬菌体P82具有良好的温度和酸碱度耐受能力，后期可将其用于动物体表和环境的消毒。噬菌体P82在感染宿主菌前存在约25 min的潜伏期，45 min的爆发期，裂解量约为74 PFU/cell。 与范锦戴等[16]分离的金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解量(约80 PFU/cell)无显著差异，高于蔡天舒等[23]所发现的金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解量(32.2 PFU/cell)。上述结果表明，噬菌体P82可快速感染金黄色葡萄球菌，将其裂解，从而起到良好的杀菌作用。

噬菌体治疗奶牛乳腺炎生产成本低、副作用少、应用广泛，同时还可采用噬菌体“鸡尾酒”疗法来规避单一噬菌体的宿主谱窄的问题。Koen等[15]建立小鼠乳腺炎模型时采用噬菌体鸡尾酒进行治疗，可安全有效地降低乳腺内病原菌的数量。本试验所筛选的噬菌体P82具有较广的裂解谱、较高的裂解能力和较好的稳定性，为后期研发噬菌体微生态制剂或作为环境消毒剂等工作奠定了基础。

4 结 论

本试验分离纯化出1株奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P82，当MOI为0.001时，其效价可达1010PFU/mL，对63株金黄色葡萄球菌裂解率为36.51%，该噬菌体对宿主菌的裂解量约为74 PFU/cell，且对温度和酸碱度耐受范围较广，后期可作为防治奶牛乳房炎的噬菌体候选株。