A型塞尼卡病毒检测方法及疫苗研究进展

王迁迁，于永乐，李月华，董雅琴，尼 博，刘拂晓

(1.青岛农业大学动物医学院，青岛 266109;2.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018;3.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032)

A型塞尼卡病毒(SenecavirusA，SVA)也称为塞尼卡谷病毒(SenecaValleyvirus，SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒属(Senecavirus)，是该属的唯一成员，且只有1个血清型[1]。2002年，研究人员偶然从人胚胎视网膜细胞PER-C6培养基中发现该病毒，最初认为是一种细胞培养液中的污染物[2]。自1988年以来，SVA一直在美国的猪群中隐性传播，直到2007年在加拿大首次发现了SVA感染病例[3]。随后，在中国、泰国、越南、哥伦比亚等多个国家相继报道了SVA感染[4-6]。2015年，中国广东省猪场发现了SVA感染的病例[7]，之后SVA逐渐蔓延到福建、河北等其他省份[7-10]。据报道，至2019年12月，中国有超过一半的省、自治区和直辖市猪群感染SVA[11]。SVA引起猪的水泡病在临床上与口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)等引起的症状难以区分。研究证实，该病毒可在猪群中垂直传播[12]，且在小鼠和家蝇样本中检测到SVA，并从小鼠粪便和小肠中分离到活病毒，表明小鼠和家蝇可能对SVA的流行有潜在的作用[13]。除此之外，亚临床感染病例的增加，SVA RNA持续存在于感染恢复期猪的扁桃体中，皆表明猪会长期带毒，使该病难以控制和消除。因此，开发快速、灵敏的检测方法及研制安全有效的疫苗对防控SVA传播至关重要。笔者就近年来SVA检测方法和疫苗研究进行综述，旨在提供有效信息以提高对SVA的综合防控能力。

1 病毒分离和组织学检测

1.1 SVA分离鉴定

病毒分离是检测病毒最可靠的方法，可用于分离培养SVA的细胞系有多种，包括人胚胎视网膜细胞PER-C6[14]、小细胞肺癌细胞H446[15]、人肺癌细胞NCI-H1299[16-17]、人胚胎肾细胞HEK293T[18]、猪睾丸细胞(ST)[19]、乳仓鼠肾细胞BHK-21[20]和BSR-T7/5[21]、猪肾细胞PK-15[22]和IBRS2[8]。SVA感染后导致这些细胞出现不同程度的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。在BSR细胞单层上可观察到SVA感染后细胞皱缩、裂解和从细胞瓶底部脱落等典型的CPE[23]。病毒分离鉴定被认为是传染病诊断的金标准，但这种方法耗时长，且不一定能分离成功。

1.2 免疫组化和原位杂交技术

基于组织学诊断是确定病原体潜在作用的最重要方法之一。免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)可用于鉴定病原体的存在及其与组织内形态学变化的关系，进一步确定病原体是否是疾病的致病因素。免疫组化识别与病原体相关的特定蛋白质，而原位杂交则检测组织切片中的病原体核酸。

1.2.1 免疫组化 免疫组化可用于检测组织样本中的病原体，Leme等[6]通过SVA单克隆抗体进行的免疫组化显示，新生仔猪易被SVA感染，由于病毒对多种组织的嗜性而导致多系统疾病。Oliveira等[24]利用免疫组化标记物将自然感染SVV的哺乳仔猪的淋巴变化联系起来发现，SVV可在仔猪体内复制和诱导淋巴细胞凋亡，首次证明SVV与哺乳仔猪淋巴组织之间的关系。虽然免疫组化可检测与组织病变相关的抗原，但其需特异性的抗体，这些抗体并不易获得，而原位杂交技术克服了这一限制。

1.2.2 原位杂交技术 RNA原位杂交技术可通过cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA的表达，已用于检测不同组织中的SVA抗原。该技术与实时荧光定量RT-PCR技术联合使用可从感染SVA动物的扁桃体中检测到SVA RNA的存在[17]。Resende等[25]开发了一种新型原位杂交技术——RNAscope来检测感染组织中的SVA RNA，这种新型原位杂交技术建立了组织学病变与病毒之间的联系，背景和非特异性染色较少，极大地消除了经典原位杂交技术中的假阳性染色。与免疫组化相比，原位杂交技术能通过靶向特定信使RNA检查组织学病变中特定病原体的存在，有助于在缺乏免疫组化商业抗体的情况下诊断新出现的病原体。

2 血清学诊断方法

现已开发出多种检测抗SVA抗体的检测方法，包括间接ELISA、竞争ELISA、均相光激化学发光免疫技术和病毒中和试验。ELISA方法因其操作简单、快速灵敏，是血清学诊断中常用的技术手段，其他新兴技术的开发也为快速检测SVA提供了可靠的血清学方法。

2.1 间接ELISA

间接ELISA只需纯化的抗原，因此不易发生改变单克隆抗体结合表位反应性的突变。VP1、VP2和VP3构成SVA的衣壳蛋白，具有较强的抗原性，可刺激动物机体产生特异性免疫反应，是SVA主要的诊断靶抗原。

2.1.1 基于VP1的ELISA方法 小RNA病毒的VP1蛋白分布在病毒颗粒的最外部，具有最强的免疫原性，已用于许多ELISA试验检测病毒抗体。抗SVA VP1蛋白抗体的测定可以作为检测SVA感染细胞的方法[10]。目前，重组VP1蛋白及其多克隆抗体的成功制备为血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料[26]。已有研究者利用纯化的重组VP1(rVP1)蛋白作为包被抗原建立了SVA VP1的间接ELISA抗体检测方法，并用大量试验和临床样本对其进行了评估，具有良好的特异性、敏感性和重复性[27-28]，通过此种方法可在SVA暴发的早期阶段检测到临床感染和非临床感染母猪的SVA血清转化及仔猪的母源抗体[29]。

2.1.2 基于VP2的ELISA方法 VP2中存在许多单克隆抗原表位，其特异性IgM抗体反应与SVA感染早期的中和抗体水平相关，比VP1蛋白更保守，更适用于血清学检测[30-31]。因此，制备重组VP2蛋白及其多克隆抗体将有助于建立SVA特异性血清学诊断方法[32]。有研究报道，与VP1和VP3蛋白相比，SVA VP2蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法具有更高的特异性和灵敏度[33]，且利用VP2蛋白建立的ELISA方法与间接免疫荧光抗体方法的符合率为95.5%[34]，与血清中和抗体试验符合率为91.9%[35]。Maggioli等[36]研究发现，VP2和VP3蛋白可能含有SVA的主要中和表位，其特异性抗体反应与SVA感染早期中和抗体水平相关。因此，开发基于VP2和VP3蛋白的ELISA检测方法有助于检测抗原筛选[37]。

2.1.3 基于VP3的ELISA方法 SVA感染的急性期，机体产生的抗体主要是抗VP2和VP3的特异性IgM；在康复期，机体产生的抗体主要是VP1、VP2、VP3的特异性IgM和IgG[36]，说明VP3蛋白在感染的早期就能产生中和抗体，可作为SVA早期检测的靶标抗体。有关VP3 ELISA方法的研究相对较少，国内学者以VP3蛋白作为包被抗原建立的ELISA方法敏感性略低于中和试验，但仍具有较高的敏感性、重复性和稳定性，为不同蛋白所建立的间接ELISA方法的对比奠定了基础[38]。

2.2 竞争ELISA

血清中的特异性抗体水平是鉴别病毒感染的有效指标。竞争ELISA被广泛用于血清抗体检测，该检测方法测定了临床样本中存在的抗体与特异性单克隆抗体之间对特定抗原的竞争。Yang等[39]开发了一种用于血清学诊断的特异性单克隆抗体，并用该抗体建立了竞争ELISA方法，然而，由于血清样本数量有限，该检测方法并未得到充分验证。2017年，Goolia等[19]利用竞争ELISA方法对SVA阳性猪血清样本及多种来源的SVA阴性血清样本进行了进一步验证，同时将竞争ELISA与病毒中和试验和免疫荧光抗体试验进行了比较。结果显示，3种方法的结果具有很强的一致性。竞争ELISA比其他检测方法更具优势，其操作更快、更简单、成本更低，但其包被灭活病毒，需要培养大量纯度较高的病毒，具有散毒的风险。而阻断ELISA以SVA VP2蛋白作为抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的针对VP2的单克隆抗体作为二抗，可减少试验过程中散毒的风险，利用该方法检测猪血清中的SVA抗体，并与中和试验进行比较，结果发现两者的符合率为70.1%[40]和96.0%[41]。

2.3 均相光激化学发光免疫技术

均相光激化学发光免疫技术(AlphaLISA)是近几年快速发展的新型检测技术，也是目前利用高通量技术进行样品检测的较好方法，已在生物研领域得到广泛应用。该技术在动物传染病上的应用较少，且目前只有国内学者开发了AlphaLISA血清学检测方法，用于临床上快速区分SVA和其他疾病，来监测国内SVA感染的流行趋势[42]。与传统ELISA方法相比，该方法具有节约血清样本、简化试验步骤和缩短整体试验时间等优点，为开发操作简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好的SVA血清学诊断试剂盒提供了新思路。目前该方法在检测病原微生物方面尚处于初级阶段，需进行大量临床样本检测来进一步验证该技术用于快速检测SVA的可行性。

2.4 病毒中和试验

病毒中和试验广泛用于评估血清中抗SVA的抗体，其对传染病进行回顾性和前瞻性血清学研究及概述动物健康状况非常重要，是确定传染源进入一个国家的时间及与感染相关风险因素的重要工具。Saporiti等[43]利用该方法对2014年巴西暴发SVA感染疫情前后的大量血清样本进行了回顾性血清学调查，结果发现在2014年之前，巴西主要生猪产区没有出现SVA。基于CPE的病毒中和试验已被用于检测针对SVA的中和抗体，野生型SVA引起的CPE在某些接毒孔中通常不太明显，无法通过常规病毒中和试验确定正确的结果，而基于表达eGFP重组病毒的病毒中和试验比单独使用野生型SVA的方法敏感性和特异性更高[21]。

3 病毒核酸检测方法

病毒核酸检测方法广泛应用于SVA RNA的检测，主要有PCR和基因组测序技术，PCR技术是常用的病毒核酸检测方法，通过PCR检测SVA核酸，加快了对该病毒的临床诊断，并帮助研究人员了解该病毒的发病机制。基因组测序技术可检测未知的RNA病毒及识别和表征样品中的整个微生物组，对鉴别新型病原体和研究特定RNA病毒的进化机制至关重要。

3.1 普通PCR

普通PCR灵敏度高，操作简单，不仅可用于实验室诊断，也适用于养殖场SVA的检测。RT-PCR可作为一种可靠的病原检测方法用于SVA的分子流行病学调查，范慧等[44]利用该技术对山东地区的猪水疱液、心脏、扁桃体等组织样本进行检测，发现山东地区SVA感染阳性率处于较低水平。Leme等[4]利用RT-PCR方法首次在巴西猪群中检测到SVA，这是第1份报告北美以外猪临床感染SVA的研究。刘涛等[45]还报道了一种能同时检测鉴别SVA和FMDV的双重RT-PCR方法，为2种病毒的鉴别诊断提供了重要的工具。

3.2 巢式PCR

与普通RT-PCR技术相比，巢式PCR技术具有更高的灵敏性和反应效率，操作简单。在普通RT-PCR中目标传染病病原体样本呈阴性的情况下，以及当其他技术不可用或需对大量样本进行病毒检测时，此方法可用于流行病学研究中的病毒检测及通过对被感染和未被感染猪群中的SVA进行常规检查来进行健康监测[46]。

3.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速等优点，广泛应用于动物疫病的检测与监测中。实时荧光定量PCR主要分为探针法和染料法，基于探针的检测方法具有更高的诊断特异性，适用于病毒感染早期检测，因此通常是分子诊断的最佳选择[47-48]。虽然染料法特异性比探针法稍差，但其成本较低，更经济，且能有效避免试验过程污染、减少试验中存在的假阳性[49]。国内外研究人员目前已开发了多种实时荧光定量RT-PCR技术来诊断SVA感染，且这些检测方法的诊断灵敏度和特异性都已用试验和/或临床样本进行了广泛的评估。这些诊断方法引物的设计针对不同的保守区域，包括3D基因[50-52]、VP1基因[53-56]、5′-UTR[57]、L/VP4基因[58]等。由于SVA与FMDV感染猪群引起的临床症状、病理变化非常相似，难以区分，需借助实验室分子诊断技术才能鉴别出来，因此一些有学者建立了FMDV和SVA的双重实时荧光定量RT-PCR方法[59-60]及针对不同血清型的FMDV和SVA的多重荧光定量RT-PCR检测方法[61]，利用同一个反应即可快速同时鉴别出SVA和FMDV，大大缩短了检测周期。这些诊断工具可在水泡病暴发期间提供SVA的早期检测，对控制和区分其他水泡病至关重要。

3.4 恒温热隔绝式PCR(iiPCR)

iiPCR技术最早由Krishnan等[62]提出，是一种基于热对流原理的全新荧光定量PCR技术，该检测方法在一个便携式机器中进行，可进行敏感和特异的现场检测。Zhang等[57]开发的基于3D基因的RT-iiPCR技术具有很高的敏感性，可检测历史和当前SVA分离株，且评估了建立的实时荧光定量RT-PCR与RT-iiPCR 2种方法对临床样本的诊断性能，结果发现这2种方法之间具有很高的一致性。

3.5 微滴式数字PCR(ddPCR)

ddPCR是一种新兴的核酸检测技术，与实时荧光定量RT-PCR、PCR相比具有一些优势，不依赖校准曲线，能对包括DNA和RNA在内的核酸进行绝对定量，已应用于多种动物和人类病毒。然而，有关该技术应用于SVA的报道较少，目前这些方法的建立主要靶向SVA 3D基因，Zhang等[63]用临床样本对RT-ddPCR和实时荧光定量RT-PCR 2种方法的检测性能进行对比发现，SVA RT-ddPCR比实时荧光定量RT-PCR灵敏度高约10倍，且一步法RT-ddPCR的检测限和分析特异性优于两步法，这为SVA的检测和绝对定量提供了一种新方法[64]。

3.6 等温扩增技术

3.6.1 重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA) RPA是近年来出现的恒温、核酸快速扩增技术，是一种相对较新的等温扩增技术，具有操作简单、灵敏度高、扩增速度快及在低温恒温下操作等优点，尤其是在缺乏支持PCR设施的环境中，这种新技术可实现及时准确地检测，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫的诊断研究。由于RPA可作为PCR有效的替代方法，因此可通过与其他平台相结合来开发灵敏度高和等温效率高的RPA，包括琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、侧流层析试纸条和荧光染料(定量)等。但目前只有国内学者开发了SVA实时荧光RPA[65]和重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)[66]检测方法。尽管目前RPA在SVA检测中的应用研究很少，但由于其设备要求简单和反应时间短，其在猪群感染SVA的现场快速诊断方面具有较大的市场潜力。

3.6.2 环介导等温扩增技术(LAMP) 基于LAMP检测RNA病毒的方法需要在恒温下孵育，无需复杂的仪器，被认为是病毒病原体检测和鉴定的替代方法。迄今为止，已开发并评估了4种LAMP技术来诊断SVA。Armson等[67]用冻干试剂开发了2种RT-LAMP，分别靶向5′-UTR和VP3-1区域，与Fowler等[51]开发的实时荧光定量RT-PCR相比，这2种方法的检测灵敏度均为100%，在12 min内即可获得结果。Zeng等[68]基于VP2区域开发了RT-LAMP检测方法，用118个现场样本对其进行了验证，并与普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR进行了对比，结果显示，该RT-LAMP表现出更高的灵敏度和效率。Li等[69]设计LAMP引物用于靶向SVA 3D基因序列的保守区域，将RT-LAMP与横向流动试纸条技术(LFD)相结合，首次开发了一种有利于SVA诊断的RT-LAMP-LFD检测方法，并将该方法与普通RT-PCR对33份血清样本进行了对比检测，结果显示，RT-LAMP-LFD方法比普通RT-PCR具有更高的临床检出率，可用于分析SVA感染的组织、囊泡和血清等临床样本。

3.7 基因组测序

病毒分离、血清学检测和PCR技术等方法需事先掌握待检测病原体的信息。因此，当检测意外出现的病毒或早期阶段的变异株时，在几乎没有相关信息的情况下，这些方法将不可避免地减慢病原体鉴定过程。多种基因组测序技术的开发可及时发现新型的病原体，测序产生的基因组信息可用于支持其他诊断方法的开发[10,70]。基因组测序技术非常便于调查病原体未知的传染病暴发，Tan等[71]以SVA为模型，评估并比较了牛津纳米孔(Oxford Nanopore)直接RNA测序(DRS)和传统的扩增测序(PCR-cDNA，PCS)对RNA病毒的快速检测和基因组生成，PCS的一致性达到了99%，远高于DRS(94%)，PCS耗时长，但可产生更准确的一致性，适用于病毒拷贝数较高的样本；DRS可直接对RNA链进行测序，耗时短，允许检测核酸碱基修饰。这2种测序方法都可用于检测未知的RNA病毒病原体，且由于测序仪的便携性使其更适用于现场诊断。二代测序可用于识别和表征样品中的整个微生物组，Liu等[23]通过二代测序技术对连续传代的重组病毒进行测序分析，揭示了SVA进化的动力学。

4 疫 苗

疫苗接种是预防和控制SVA最有效的方法。然而目前防控该病仍无商品化疫苗，大量的亚临床感染增加了控制该病传播的难度。因此，亟需开发安全有效的SVA新型疫苗，国内外学者已开发了多种候选疫苗用于预防SVA感染。

4.1 弱毒疫苗

目前弱毒疫苗的开发主要利用反向遗传学技术拯救重组的SVA毒株，SVA全长cDNA感染性克隆的构建有助于后续改良活病毒疫苗的开发[72]。Sharma等[73]描述了一种利用反向遗传学技术开发的重组减毒SVA活疫苗(rSVAm SacⅡ)，用该活病毒和灭活的病毒制剂通过肌内(IM)或鼻内(IN)途径免疫4周龄仔猪来评估rSVAm SacⅡ的免疫原性和保护效力，结果发现，单剂rSVA mSacⅡ活病毒引起的抗SVA中和抗体(NA)水平显著高于两剂rSVA mSacⅡ灭活疫苗制剂，表现出对异源SVA毒株攻击后的保护作用，因此该弱毒株可能是预防和控制猪SVA暴发的良好候选疫苗，但仍需更多的研究来评估这种病毒在免疫群中传代的遗传稳定性。

4.2 灭活疫苗

灭活疫苗不含任何活性成份，与弱毒疫苗相比其安全性更高，诱发疾病的风险低。迄今为止，已分离出了多种SVA毒株，一些分离株灭活之后免疫猪表现出良好的免疫原性和保护效力，来自中国福建的SVA分离株CH-FJ-2017，是报道的第1个可用于控制SVA感染的候选疫苗株，Yang等[74]在猪中评估了该灭活疫苗的免疫原性，发现用2 μg疫苗制剂免疫的动物产生了更高滴度的NA抗体，并保护猪免受同源SVA攻击。 然而，免疫1/3或1/9疫苗剂量的动物会产生较低水平的NA抗体，且只能部分保护猪免受SVV感染。2018年从中国广东分离的1株SVA毒株(GD-ZYY02-2018)灭活后也被证明对受同源病毒攻击的育肥猪具有保护作用[75]。Li等[76]证实小鼠是初步评价SVA疫苗免疫原性和保护效果的候选动物模型，利用该模型评估了2019年在河南分离的SVA毒株CH-HNCY-2019，结果发现，灭活的SVA CH-HNCY-2019疫苗具有免疫原性，可完全保护小鼠免受同源株攻击。

4.3 核酸疫苗

核酸疫苗是基于克隆到递送质粒中的DNA或直接注射信使RNA，经济高效，内源性蛋白质的合成模拟了自然感染，因此，抗原以其天然形式呈递，可诱导动物机体产生细胞免疫和体液免疫应答，没有感染的风险。基于核酸疫苗的一些应用潜力，魏婷等[77]构建了含有SVA P12A-3C编码序列的真核表达质粒并在小鼠免疫中初步证实该表达质粒能诱导动物机体产生一定的免疫反应，但该表达质粒引起的免疫反应较低，需进一步优化来提高核酸疫苗的免疫效力。

4.4 亚单位疫苗

亚单位疫苗通过将免疫原注入动物体内来刺激机体产生免疫反应，与传统疫苗相比其安全性好，不良反应小。SVA VP1蛋白是具有较强免疫原性的结构蛋白，有研究发现，利用SVA VP1重组蛋白联合佐剂免疫小鼠可诱导小鼠体内产生免疫应答且效果良好，SVA亚单位候选疫苗可能成为预防SVA传播的有力工具[78]。表位的研究是当前的热点，鉴定出的抗原表位对设计SVA表位疫苗具有潜在的价值。目前，已成功鉴定出了多个线性B细胞抗原表位[79]和T细胞抗原表位[80]，这些T细胞和B细胞抗原表位的成功鉴定有助于表位疫苗的研发和检测方法的建立。病毒样颗粒(VLPs)具有与天然病毒粒子相似的结构特征，但不含病毒基因组，因而不具感染性，是目前基因工程疫苗研究的热点。莫亚霞等[81]成功表达出具有良好反应原性的SVA衣壳蛋白VP0、VP1和VP3，去除His-MUMO后还原天然构象的目的蛋白可组装成五聚体，为制备SVA VLPs奠定了物质基础。Mu等[82]、伍春平等[83]开发的SVA VLPs疫苗在免疫动物后能诱导产生较高水平的特异性中和抗体，为SVA的预防和消除提供了一种优于灭活疫苗的候选疫苗。

5 小 结

SVA感染的临床症状与其他重要的水泡性疾病(如口蹄疫)难以区分，可能导致破坏性的经济损失。因此，SVA感染的暴发可能会对中国养猪业产生重大影响。SVA的快速诊断对于识别病原体和鉴别临床上难以区分的传染病非常重要。目前已建立了适用于实验室、现场等多种检测方法，但有关SVA疫苗的研究报道相对较少，且无商品化疫苗用于预防SVA感染。SVA自发现以来一直在不断地进化，这可能导致病毒致病性增强及临床病例不断出现。SVA在受感染的猪群中可水平和垂直传播，猪免疫力下降及病毒在动物和环境中持续存在可能在猪群中引发新的暴发。目前，除了畜牧业生物安全体系外，尚无有效预防SVA感染的策略和方法，因此加强饲养管理，包括环境中鼠、苍蝇等传播媒介的清除，减少饲养密度，提高动物机体的免疫力，同时加强在猪群中对SVA的主动监测，将能有效防控该病的大范围暴发。