西藏传统发酵酸奶源低温乳酸菌的筛选

文华英，贾福晨，靳玉龙，张玉红

西藏自治区农牧科学院农产品开发与食品科学研究所，西藏拉萨 850000

0 引言

独特的生存环境孕育着独特的生物资源，西藏有“世界第三极”之称，拥有中国极端环境条件下宝贵而独特的微生物种质资源[1]。西藏传统发酵酸奶的制作和食用有数千年历史，因气候环境和地理因素差异大以及制作工艺的不同[2]，孕育出的乳酸菌特性也不同[3]，其中不乏具有优良益生特性和生产特性的低温乳酸菌菌株[2]，其能在低温环境下生长、繁殖，在工农业生产、生物修复、污水处理和医药等领域均具有良好的应用[4～6]，尤其在食品工业和水果加工领域，低温在节能以及保留住不稳定和易挥发的风味化合物，防止污染和消除任何残留的酶活性等方面的优势不断凸显[5]，用低温工艺取代高温工艺的趋势一直在增长。

低温乳酸菌具备保鲜、抑菌和益生功能，可在低温工艺下发挥作用，围绕其开展的低温发酵研究涉及发酵乳制品、青贮饲料、肉制品、泡菜和食品生产等[7，8]。因此，进一步加深对低温乳酸菌资源的认识和开发，具有重要意义。筛选特性优良的低温乳酸菌，不仅能为低温发酵提供菌种资源储备，还能为筛选优异菌株及其商业化开发提供依据，为我国开发优良直投菌剂提供了有利保障[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验菌株的来源与信息

13 株乳酸菌分离于西藏拉萨市、昌都市、那曲市和日喀则市农牧民家采集的传统发酵酸奶样品，

用MEGA7.0软件绘制系统进化树如图1。

图1 基于16S rRNA序列构建系统发育树

1.1.2 主要培养基及试剂

MRS培养基、MRS肉汤；鸟氨酸脱羧酶生化鉴定管、赖氨酸脱羧酶生化鉴定管、精氨酸脱羧酶生化鉴定管、氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管、Kovacs靛基质试剂、蛋白胨水、无菌液体石蜡，环凯微生物科技有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 主要仪器与设备

生物显微镜（UB203i），北京博雅创新科技发展有限公司；涡旋振荡器（Vortex.Genie2），美国Scientific Industries公司；分析天平（BS223S），赛多利斯科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV7502PCS），上海欣茂仪器有限公司；恒温培养箱（LRH-250）、电热恒温水浴锅（HWS-28），上海齐欣科学仪器有限公司；离心机（TGL-16G），上海安亭科学仪器厂；pH酸度计（PH400），安莱立思仪器科技有限公司；等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液的制备

从平板单菌落挑取一环试验菌株至MRS液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，活化2～3 次。测定OD600nm值，通过稀释制备接种浓度为OD600nm值等于0.6的菌液，按3%（v/v）的比例接种。

1.2.2 耐低温乳酸菌筛选

根据文献[10]适当修改，菌液接种至含4 mL MRS液体培养基中，放置于10 ℃恒温培养箱中静置培养，每个试验组设置3 次重复。分别测定培养2 d、4 d和6 d时的OD600nm值和pH值。

1.2.3 不同温度下生长情况测试

根据文献[10、11]适当修改，菌液接种至含4 mL MRS液体培养基中，每个试验组设置3 次重复。分别放置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃恒温培养箱中静置培养48～72 h，利用紫外分光光度计测定OD600nm值。

1.2.4 耐盐特性分析

根据文献[12、13]进行改良，制备NaCl浓度为2%、4%、6%和8%的MRS液体灭菌培养基。将菌液接种至4 mL上述培养基中，每个试验组设置3 次重复。分别放置于30 ℃、37 ℃恒温培养箱中静置培养48～72 h，利用紫外分光光度计测定OD600nm值。

1.2.5 耐酸特性分析

根据文献[14]进行改良，制备pH值为3、3.5、4和5的MRS液体灭菌培养基。将菌液接种至4 mL上述培养基中，每个试验组设置3 次重复。分别放置于30 ℃、37 ℃恒温培养箱中静置培养48～72 h，利用紫外分光光度计测定OD600nm值。

1.2.6 产酸能力分析

根据文献[15]适当修改，将菌液接种至4 mL含6%NaCl的MRS液体培养基无菌离心管中，每个试验组设置3 次重复。分别放置于30 ℃、37 ℃恒温培养箱中静置培养48～72 h，使用pH计测定菌株培养液的pH值。

1.2.7 降亚硝酸盐特性分析

（1）标准曲线的绘制

根据《GB5009.33—2016食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸萘乙二胺法绘制标准曲线。

（2）菌液中亚硝酸盐含量测定

根据文献[16]适当修改，将菌液接种于2 mL亚硝酸盐质量浓度为125 μg/mL的MRS液体培养基中，每个试验组设置3 次重复。分别放置于30 ℃、37 ℃恒温培养箱中静置培养。于24 h和48 h分别取样，按照标准回归方程计算亚硝酸盐含量。降解率按以下公式计算：

式中：X为菌株亚硝酸盐降解率，%；C0为原培养基中亚硝酸盐质量浓度，μg/mL；C1为测试样品亚硝酸盐质量浓度，μg/mL；100为换算系数。

1.2.8 氨基酸脱羧酶试验和吲哚试验

氨基酸脱羧酶试验：根据文献[13]进行改良，按照氨基酸脱羧酶生化鉴定管（环凯）说明书操作。

吲哚试验：配制5 mL/管的蛋白胨水培养基，高温灭菌。菌液接种于蛋白胨水培养基中，未接种的蛋白胨水培养基为空白对照，37 ℃恒温培养48～72 h。向培养基中滴加5～8 滴靛基质试剂，并轻摇试管观察颜色变化。若液面出现红色则为阳性结果，否则为阴性结果。

1.3 数据分析

采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）；使用Excel软件进性数据分析并绘制柱状图和折线图，数据用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 低温乳酸菌初筛

2.1.1 低温生长能力测试

13 株乳酸菌在10 ℃条件下培养2 天、4 天以及6 天，测定OD600nm值和pH值，统计如表1。从表1可以看出，10 ℃条件下CD3和CD5生长速度最快，OD600nm值高且pH值低的8 株菌分别为CD5、CD3、CD33、RK17、CD14、NQ9、NQ37、CD10，以此8 株菌开展后续特性分析试验。

表1 13 株乳酸菌10 ℃条件下培养2 天、4 天及6 天的菌液OD600 nm值和pH值

2.1.2 不同温度下生长能力分析

共计9 株菌，设置7 个温度梯度，测试不同温度下OD600nm值，绘制生长曲线见图2。结果显示：CD3和CD5的生长情况明显好于其余试验菌株；其中CD5最适生长温度为25 ℃，其余均为30 ℃；RK17、CD33对温度最敏感，RK17在20 ℃后生长迅速，CD33在20～30 ℃条件下生长较为良好，二者在37 ℃时生长明显下降；RK23在30～40 ℃区间生长差异不大。因结果显示试验菌株最适生长温度多为30 ℃，而文献多以37 ℃为试验温度，遂设置30 ℃和37 ℃两个试验温度开展后续特性研究试验，对比差异。

2.2 特性研究

2.2.1 耐盐能力分析

耐盐能力见表2。可以看出，在8%NaCl浓度环境下，30 ℃时，CD3和CD5生长良好，CD14和CD33能生长；37 ℃时，NQ37微弱生长，其余7 株能生长。综上，30 ℃条件下的CD3和CD5耐盐性能最好。

表2 不同盐度条件下8 株乳酸菌的生长特性测定

2.2.2 耐酸能力分析

8 株乳酸菌，设置4个pH梯度，耐酸能力见表3。可以看出，30 ℃条件下的CD3和CD5耐酸性能最好，其余菌株在pH值3.5及更低pH值条件下均微弱生长或不生长，体现出较差的耐酸性能。

表3 不同pH值条件下8 株乳酸菌的生长特性测定

2.2.3 产酸能力分析

根据显著性差异分析，由图3可以看出，培养温度不同，产酸能力有所差异，但对CD3和CD5影响较小。综上，CD5和CD3的产酸能力最强，其次为30 ℃时的CD14和CD33。

图3 30 ℃和37 ℃培养条件下乳酸菌的pH值对比

2.2.4 降亚硝酸盐特性分析

根据1.2.7（1）方法，测定不同浓度亚硝酸钠标准液在反应后的OD538nm值，绘制得到标准曲线如图4。回归方程为：y=0.7363x，R2=0.9974。

图4 标准曲线图

试验菌株的亚硝酸降解率如图5。根据显著性分析，从图5可以看出，菌株培养24h时，CD5、CD3、CD10和NQ9体现出较强的亚硝酸盐降解能力。在37 ℃时，CD5和CD3降解率接近90%，CD10和NQ9降解率接近70%，显著高于30 ℃时。

图5 24 h时30 ℃和37 ℃条件下亚硝酸盐降解率

根据显著性分析，从图6可以看出，菌株培养48 h时，CD5、CD3、CD10和NQ9体现出较强的亚硝酸盐降解能力。在37 ℃时，CD3和CD5的降解率达99%，CD10和NQ9达85%以上，其次RK17达75%以上。在30 ℃时，CD3和CD5的降解率达97%，与37 ℃时无显著差异。

综合图5和图6可知，CD3和CD5的亚硝酸盐降解率最高，其次为CD10和NQ9，且在37 ℃条件下比30 ℃时降解率更高。

图6 48 h时30 ℃和37 ℃条件下亚硝酸盐降解率

2.2.5 氨基酸脱羧酶试验和吲哚试验

生物胺与吲哚生成结果如表4所示，8 株试验菌株的赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验和吲哚试验反应均为阴性；而精氨酸脱羧酶试验中CD3、CD5、CD14和RK17反应呈阴性，表明这4 株菌不会将精氨酸经精氨酸脱羧酶作用生成精胺对人体造成安全隐患，对比其余4 株阳性结果菌相对安全。

表4 乳酸菌生物胺与吲哚生成结果

3 结论

本研究以从西藏拉萨市、昌都市、那曲市和日喀则市采集的传统发酵酸奶样品中分离出的13株乳酸菌为试验菌株。通过10 ℃低温条件培养筛选出的Lactobacillus paracaseiCD3和CD5，最适生长温度分别为30 ℃和25 ℃，其耐盐、耐酸、降亚硝酸盐特性较好，产酸能力较好，精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸脱羧酶试验呈阴性，吲哚试验呈阴性，表明其能适应低温生长，可在高盐低pH值的环境中生长，发酵时产酸性能较强，在发酵过程中可降解亚硝酸盐并且不分解精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸，以避免对人体产生危害，可作为低温发酵菌种资源。下一步研究将进一步探索CD3和CD5的益生和发酵等特性，研究其作为直投发酵菌剂是否具有优势。