含羧甲基纤维素钠的发酵乳中脂肪检测技术

刘芳芳 薛敏敏 吴 倩 彭程程 邓凌云

(湖南省产商品质量检验研究院，湖南 长沙 410011)

发酵乳是一种口感风味俱佳的乳制品，富含多种营养成分，具有促进消化、防止乳糖不耐、降低胆固醇等多种功效，深受广大消费者的喜爱[1-4]。目前，发酵乳的消费比例在中国液态乳制品中已高达50%[5]。

脂肪含有200多种不同类型的脂肪酸和大量甘油三酯，是发酵乳中风味物质及营养功效的主要来源[6-8]，同时也是发酵乳产品质量监测的重要指标，其在发酵乳中最常用的国家标准检测方法为碱水解法[9-10]。但是在实际工作中发现，采用碱水解法测定含有羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的发酵乳中脂肪时，结果显示偏低。由于发酵乳在生产过程中，通常会添加各类稳定剂保障其酸性体系的稳定性，而CMC-Na作为一种离子型纤维素胶，具有增稠、持水、乳化、悬浮等功能特点[11]，可防止酪蛋白聚集沉淀分层，并且价格低廉来源广，被广泛使用和研究[12-13]。但暂未发现关于CMC-Na影响发酵乳中脂肪测定的相关研究报道，仅宋艳梅等[14]研究表明果胶和明胶两种不同稳定剂的添加使得发酵乳中脂肪测定结果偏低。因此，有必要深入了解CMC-Na的添加对发酵乳中脂肪检测的影响。

研究拟通过深入分析碱水解法测定发酵乳中脂肪的技术原理，对含CMC-Na的发酵乳中脂肪测定偏低进行溯源分析，并对脂肪检测方法进行特定条件优化，以期开发出具有更高准确度的含CMC-Na发酵乳中脂肪的检测方法，为日常检测判定提供新的技术思路，也为未来国标的修订提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

全脂纯牛奶：蒙牛乳业(集团)股份有限公司；

20款市售风味发酵乳：德人牧香、光明、蒙牛、伊利、认养一头牛、德亚、君乐宝等多家企业不同系列产品(其中两款含CMC-Na)，市售；

蔗糖：成都太古糖业有限公司；

发酵菌粉(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)：昆山佰生优生物科技有限公司；

羧甲基纤维素钠：食品级，河南万邦化工科技有限公司；

氨水、无水乙醇、无水乙醚、石油醚(沸程30～60 ℃)、盐酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：SI-234型，丹佛仪器北京有限公司；

食品均质器：SJ-Ⅱ型，上海昆虫科技开发公司；

生化培养箱：BD115E2型，德国Binder公司；

毛式抽脂瓶：容量100 mL，合肥市三元化玻仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：HWS-28型，上海一恒科学仪器有限公司；

电热鼓风干燥箱：DHG-9240A型，北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 制备含CMC-Na的发酵乳 将脂肪含量为3.91 g/100 g 的全脂纯牛奶等量取样7份，分别加入不同量的CMC-Na，配制成CMC-Na添加量分别为0.00%，0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%的牛奶样品，再加入6%的蔗糖。将配制好的样品在30 MPa 下均质处理，108 ℃灭菌15 min，取出后冷却至40～45 ℃备用。各样品按1 g/L依次加入发酵菌粉，充分搅拌混匀，放入42 ℃恒温培养箱中发酵8 h，取出后放入4 ℃冰箱贮藏待测。

1.2.2 碱水解法关键条件的优化 对GB 5009.6—2016第三法碱水解法中关键条件进行优化调整。选择氨水体积、水解温度、水解时间、提取次数4个关键试验参数，通过依次改变其中一个参数的水平条件，保持其他参数与国标方法相同(氨水体积2.0 mL，水解温度65 ℃，水解时间20 min，提取次数3次)的情况下，对CMC-Na添加量为0.50%，0.75%，1.00%的3个发酵乳样品逐一进行脂肪分析检验。其中，氨水体积的优化水平有4.0，6.0，8.0 mL；水解温度的优化水平有75，80，85 ℃；水解时间优化水平有30，45，60 min；提取次数的优化水平有4，5，6次。最终对比条件优化后结果与国标方法结果的区别。

1.2.3 盐酸水解对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的影响

参照碱水解中的参数条件，使用盐酸替代氨水进行酸水解提取发酵乳中的脂肪。以市售含有CMC-Na的2款发酵乳产品，及CMC-Na添加量分别为0.00%，0.50%，0.75%，1.00%的自制发酵乳为研究对象，各取5份平行样品，分别对应添加2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 5个体积梯度的盐酸，之后从水浴水解步骤开始按碱水解法中步骤操作。最后对比各试验条件下的检测结果，考察盐酸水解对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的适用性。

1.2.4 碱水解法中加入金属离子对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的影响 由于CMC-Na是一种聚电解质，当溶液中离子强度改变时，其黏度特性也会发生改变[15]，因此，针对CMC-Na含量不同(0.50%，0.75%，1.00%)的发酵乳，分别加入0.00，0.01，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 mol/L NaCl、KCl、CaCl2溶液，然后采用碱水解法对含有不同种类、不同浓度金属离子的样品进行脂肪测定，对比分析各金属离子对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的影响。

2 结果与分析

2.1 基于国标碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的结果分析

依据GB 5009.6—2016碱水解法对20款市售风味发酵乳及自制CMC-Na含量不同的发酵乳进行脂肪测定，结果见表1。结果显示，以CMC-Na为主要添加剂的两款产品(编号1和编号2)脂肪检测结果分别为2.33，2.35 g/100 g，远低于标示值2.7，3.2 g/100 g，并且GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》规定风味发酵乳的脂肪含量不得低于2.5 g/100 g，由此可判定上述两款产品脂肪不合格。而其余产品的脂肪检测结果则与其标示值接近，且均符合产品标准合格要求，产品配料表显示，其余产品并未添加CMC-Na，大部分以羟丙基二淀粉磷酸酯、乙酰化淀粉二磷酸酯、果胶、琼脂等作为主要增稠剂。

表1 20款市售风味发酵乳中脂肪测定结果Table 1 Determination results of fat in 20 commercial flavor fermented milk g/100 g

此外，通过对CMC-Na添加量为0.00%，0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%的自制发酵乳中脂肪含量进行测定。检测过程中发现，不含CMC-Na的对照样管壁上光滑无附着物，含0.10%和0.25%CMC-Na的毛式脂肪管壁上有少量细小颗粒状物质，但添加量超过0.50%后，毛式脂肪管壁上开始呈现胶状物质，且随着CMC-Na添加量的增加，胶状物质增多，当添加量达到1.25%时，胶状物质已基本覆盖整个管壁。

从脂肪测定结果(图1)可知，当CMC-Na添加量低于0.25%时，脂肪检测结果基本持平，无明显下降趋势，但当CMC-Na添加量达到0.50%时，脂肪含量明显下降，为3.74 g/100 g，比未添加CMC-Na的发酵乳下降0.17 g/100 g，而CMC-Na添加量为0.75%，1.00%，1.25%的发酵乳脂肪结果则分别为3.56，3.39，3.05 g/100 g，差值最高达到0.86 g/100 g。根据GB 5009.6—2016第三法规定，当样品脂肪含量≤5%时，同一样品两次测定结果的绝对差值不应超过0.1 g/100 g，当CMC-Na添加量达到0.50%后，脂肪检测结果随CMC-Na添加量的增加而明显减小，远超出标准要求范围。说明CMC-Na的加入可能造成国家标准方法碱水解法对发酵乳中脂肪检测结果偏低，甚至造成产品的不合格判定。

图1 不同CMC-Na含量的发酵乳脂肪测定结果Figure 1 Determination results of fat in fermented milk with different CMC-Na content

2.2 碱水解法关键条件的优化对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的影响

在国标方法的基础上，逐一对碱水解法中氨水体积、水解温度、水解时间、提取次数4个关键条件进行优化调整，对CMC-Na添加量为0.50%，0.75%，1.00%的发酵乳中脂肪进行测定，结果见图2。从图2可以看出，随着氨水体积的增加、水解温度的提高、水解时间的延长、提取次数的增加，不同CMC-Na添加量水平下发酵乳中脂肪的测定结果无明显变化规律，均未提高，并且每个试验条件变化下脂肪测定结果间的偏差值均在0.1 g/100 g的范围内。由此可见，碱水解法中关键条件的参数变化对含CMC-Na发酵乳中脂肪检测结果不会产生明显影响，可能与CMC-Na的化学特性及发酵乳中脂肪的存在形式有关。

图2 碱水解法中关键条件优化对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定结果的影响Figure 2 Determination results of fat in fermented milk with CMC-Na by optimization test of key parameter in alkali hydrolysis

乳中脂肪主要由酪蛋白包裹以脂肪球的形式存在[16-17]，碱水解法通过氨水破坏酪蛋白膜而使脂肪球游离出来，再用有机试剂进行提取，而CMC-Na在发酵乳中的功能作用是通过其胶体特性吸附在酪蛋白表面形成交联网状结构，产生静电排斥和空间位阻作用使发酵乳体系达到稳定[18]14。因此，针对含有CMC-Na发酵乳中脂肪的提取，必须先破坏CMC-Na的胶体作用。但CMC-Na黏度在pH 6～9时最大，pH 7时保护胶体性最佳，pH为10或更高时，对黏度影响较小甚至有微小增高现象[19-20]，因此，碱水解环境基本不影响CMC-Na的胶体性及黏度，使得碱水解过程中氨水很可能无法充分水解酪蛋白，使得脂肪无法得到充分释放游离，造成脂肪抽提不完全。而且CMC-Na添加量越高，胶体覆盖吸附酪蛋白越全面，有机溶剂抽提过程中不溶的胶状物质越多，脂肪得到充分水解游离及完全抽提的概率越小，使得测定结果越低。因此，在碱性环境不变的情况下，以及无其他影响CMC-Na化学特性的因素存在下，仅通过改变氨水体积、水解温度、水解时间以及抽提次数，并不会对脂肪的测定产生有效影响。

2.3 盐酸水解对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的影响

在碱水解法中各参数条件不变的情况下，用不同体积的盐酸代替氨水对含CMC-Na的发酵乳进行脂肪测定，结果见表2。由表2可知，2 mL盐酸水解时，不含CMC-Na的发酵乳中脂肪测定结果，与碱水解法测定结果基本一致，并且CMC-Na添加量为0.50%，0.75%，1.00%时，2 mL盐酸水解结果分别为3.90，3.89，3.92 g/100 g，与碱水解法测定不含CMC-Na发酵乳的结果偏差最高为0.02 g/100 g，在国标规定的0.1 g/100 g的允差要求内，可认为检测结果一致。同时，采用2 mL盐酸对市售两款含有CMC-Na的产品进行水解，其脂肪测定结果分别为2.73，3.11 g/100 g，与标示值2.7，3.2 g/100 g接近。但随着盐酸体积的增加，脂肪测定结果逐渐提高，4 mL时，检测结果提高了0.04～0.08 g/100 g，但基本还在偏差要求范围内，但当盐酸体积增至6 mL时，脂肪检测结果有了明显提升，偏差均超过了0.1 g/100 g，最高达到0.19 g/100 g，当体积增至8，10 mL时，结果基本稳定，但偏差最高达到0.27 g/100 g，并且提取物中出现黑色焦状物。

表2 不同体积盐酸水解对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定结果的影响†Table 2 Determination results of fat in fermented milk containing CMC-Na by hydrolysis with different volumes of hydrochloric acid g/100 g

试验结果表明，参照碱水解法中的参数条件，可采用2 mL盐酸替代氨水水解含CMC-Na的发酵乳，其脂肪测定结果即可到达正常值。根据相关研究[21]，当pH降低时，CMC-Na体系部分负电荷得到中和，分子链卷曲，黏度减小，pH过低时则形成CMC-Na游离酸而沉淀，从而破坏了CMC-Na与酪蛋白的吸附，进而盐酸水解脂肪球膜，释放脂肪。但当盐酸体积升高至6 mL及更高时，脂肪测定结果偏高且出现黑色焦状物，有研究[22]表明该现象主要是由于分解物和水一同混入所致，当有机溶剂挥干后，则会产生黑色焦油状物质；随着盐酸浓度的增大，可能导致样品过度水解，同时加剧了糖类等物质的炭化，更多分解产物混入而使检测值偏高。

2.4 金属离子对碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的影响

2.4.1 Na+、K+对碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的影响 由图3和图4可知，Na+与K+的变化趋势基本一致。Na+、K+的浓度越高，含CMC-Na发酵乳的脂肪测定结果越高，并在金属离子浓度达到0.5 mol/L时，含不同浓度CMC-Na的发酵乳脂肪测定值基本达到稳定，与不含CMC-Na发酵乳的碱水解测定结果(3.91 g/100 g)一致。CMC-Na是一种阴离子型聚电解质，通过同性电荷的静电排斥作用使得分子链得以伸展，呈现高黏度及稳定等特性[23]。研究[18]27[24]表明，加入Na+、K+后，溶液中离子强度发生改变，使得CMC-Na部分阴离子静电场得到平衡，同性电荷的静电排斥作用减弱，分子链卷曲体系粒径变小，黏度降低；同时，使得阴离子聚合物pKa值降低，降低了CMC-Na与酪蛋白的吸附作用。因此，可能减弱了CMC-Na对氨水水解酪蛋白膜的阻碍，使得脂肪测定结果随Na+、K+浓度的增加而增加，最终达到提取完全。

图3 NaCl对碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的影响Figure 3 Effects of NaCl on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

图4 KCl对碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的影响Figure 4 Effects of KCl on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

2.4.2 Ca2+对碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的影响 由图5可知，Ca2+对含CMC-Na发酵乳中脂肪测定的影响与Na+、K+不同。随着Ca2+浓度的增加，在低浓度0.01，0.05 mol/L时，脂肪的测定结果存在小幅的上升，随后浓度再增加时，脂肪测定结果显著下降，甚至低于未加金属离子时的脂肪结果。研究[25-26]表明，Ca2+的加入，一开始时会因阳离子抵消了CMC-Na部分阴离子聚合电解质效应，使其黏度降低，与酪蛋白吸附成网状结构的能力降低，因而脂肪测定结果会部分提高，但当钙离子增加时，高分子会通过钙发生螯合作用形成超结构，使得CMC-Na黏度进一步增加，与酪蛋白的结合更加牢固，可能导致氨水水解酪蛋白膜的效果更差，脂肪测定结果更低。

图5 CaCl2对碱水解法测定含CMC-Na发酵乳中脂肪的影响Figure 5 Effects of CaCl2 on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

3 结论

当发酵乳中CMC-Na添加量达到0.50%时，会使得脂肪含量的检测结果明显偏低，并且碱水解法中关键条件(氨水体积、水解时间、水解温度、提取次数)的调整，不会提高含有CMC-Na发酵乳中脂肪测定的准确性。但当采用2 mL盐酸水解含CMC-Na不同添加量(0.50%，0.75%，1.00%)的发酵乳时，即可使得其脂肪测定结果趋于正常；此外，通过在碱水解法中加入一定浓度的Na+或K+(0.5 mol/L及以上)，同样可以改善含CMC-Na发酵乳的脂肪测定结果。

CMC-Na的添加对发酵乳中脂肪的测定存在不利影响，容易造成产品的不合格判定，在日常检测中，需重点关注该现象，及时改进检测方法，避免产品误判。但是，随着添加剂种类的增多，可能还有其他添加剂影响关键成分准确测定的现象出现，需要对日常检测工作中的异常现象进行及时总结，对相关添加剂的化学特性进行深入了解，从而推动国家标准方法的改进修订，以保证产品质量的精准判定，同时也为企业对添加剂的选择提供一定参考。