基于高通量测序技术分析菜心切口处微生物多样性

家志文，陈学玲，范传会，梅 新，施建斌，隋 勇，蔡 沙，熊 添，何建军

（湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064）

菜心，别名菜薹，因其味美清甜、营养丰富而广受消费者欢迎。在贮藏过程中，由于菜心切口处带有明显的机械损伤，因此水分挥发和呼吸作用的加快会导致其出现萎蔫、发黄等品质变化。此外，切口处极易为微生物的滋长提供适宜条件，进而产生腐败变质。

以往对微生物菌群组成的研究中，人们主要通过传统的培养技术分离、纯化微生物，不仅费时费力，而且会因为人工操作的误差而产生带有偏见性的结果。随着分子生物学的发展，后续又产生了变性梯度凝胶电泳方法，这弥补了传统培养方法的部分缺陷，但灵敏度有待提高。近些年，高通量测序技术得到快速发展，由于其对大批量的DNA测序具有显著优势，且能够提供高灵敏度和无偏性的测试结果，因此越来越受到研究者的青睐。目前，已有研究人员使用高通量测序技术对例如樱桃、鲤鱼、酸奶等食品中的微生物多样性进行了测试。现有菜心相关研究主要包括：品种选育、保鲜加工、品质评价等，其中保鲜加工研究较为广泛。已有研究使用低温、气调、辐射、薄膜包装、臭氧、保鲜剂、褪黑素、壳聚糖和基因工程等手段来改善菜心贮藏品质，但对于菜心中微生物多样性的研究却并不多。

本研究使用高通量测序技术对不同贮藏时期菜心切口处的微生物多样性进行比较分析，以期明确贮藏过程中菜心切口处的优势菌群。研究结果可为相关保鲜剂的后续功能测试，延长菜心的保鲜期和货架期提供基础条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜心采收于湖北黄冈罗田县恒然生态农业科技发展有限公司基地，挑选无病虫害、无枯叶的菜心带回实验室备用。

磷酸盐缓冲液 赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

SQP称量天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DSX-24L手提式高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；BCM-1000超净工作台 苏州净化设备有限公司；SHA-B恒温摇床 国华（常州）仪器制造有限公司；3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；YC-260L冷藏冰箱 中科美菱低温科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菜心切口处微生物的取样

称取25 g菜心切口组织样品，使用手术剪将其剪成3 mm×3 mm×3 mm的小块。之后倒入装有225 mL磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，放入25 ℃摇床中振荡20 min，后续使用超声波振荡10 min。重复该过程一次。将混合缓冲液300 r/min离心5 min去除植物组织，取上清液8 000 r/min离心15 min，去掉上清液，所得沉淀即含有切口处的微生物样本，将样本置于－80 ℃冰箱冻存。每个贮藏时间点取3 组平行样本。

1.3.2 微生物样本高通量测序和数据分析

将所得微生物样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq技术测序平台进行高通量测序，使用该公司的生信云平台（https://cloud.majorbio.com/）及Excel软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 菜心贮藏期间切口处微生物群落的α多样性分析

其中Chao指数、Sobs指数反映群落的丰度，覆盖率反映群落的覆盖度，Shannon指数则反映了群落的多样性。本研究对不同贮藏时期的菜心共9 个样品进行了测序分析，按照最小样本数进行抽平，并以97%的相似度进行分类，共得到1 016 个OTU（真菌：548 个；细菌：468 个）。如图1、2所示，各样本的稀释度曲线随着测序深度的增加逐渐趋于平缓，表明送测样本量合理，可以较好反映样品中的微生物多样性情况。此外，如表1、2所示，不同贮藏时间的样本中微生物的覆盖率都大于99.9%，表明送测样本的测序结果可以反映实际贮藏情况。

表1 不同样本中真菌的α多样性指数Table 1 Fungal diversity index in different samples

图1 样本中真菌稀释性曲线Fig.1 Rarefaction curves of fungi in samples

图2 样本中细菌稀释性曲线Fig.2 Rarefaction curves of bacteria in samples

表2 不同样本中细菌的α多样性指数Table 2 Bacterial diversity index in different samples

2.2 基于门水平的菜心切口处菌群组成分析

2.2.1 基于门水平的真菌组成分析

如图3所示，在门分类水平上，真菌主要由担子菌门（Basidiomycota）（早期43.46%、中期68.82%、后期55.27%）、子囊菌门（Ascomycota）（早期43.23%、中期26.59%、后期40.65%）和unclassified Fungi（早期13.29%、中期4.60%、后期4.07%）组成。担子菌门和子囊菌门在贮藏早、后期相对丰度相似，在贮藏中期担子菌门的相对丰度最高。基于门水平的微生物多样性并未因为贮藏时间的延长而变化。

图3 基于门水平的真菌组成Fig.3 Fungal community composition at the phylum level

2.2.2 基于门水平的细菌组成分析

如图4所示，在门分类水平上，贮藏早期细菌主要由厚壁菌门（Firmicutes）（58.11%）和变形菌门（Proteobacteria）（29.52%）组成，贮藏中、后期，细菌主要由厚壁菌门（38.12%、19.73%）、变形菌门（8.25%、23.82%）、放线菌门（Actinobacteria）（14.95%、12.62%）和拟杆菌门（Bacteroidetes）（2.95%、7.27%）。蓝细菌门（Cyanobacteria）虽然在整个贮藏期间持续存在（早期10.89%、中期35.56%、后期36.48%），但其在本研究中的真实分类学地位需要谨慎确定。随着贮藏时间的延长，细菌菌群多样性稍有增加。

图4 基于门水平的细菌组成Fig.4 Bacterial community composition at the phylum level

2.3 基于属水平的菜心切口处菌群组成分析

2.3.1 基于属水平的真菌组成分析

如图5 所示，在整个贮藏期间，汉纳酵母属（）都占有主要优势（早期21.36%，中期22.81%，后期22.25%）。随着贮藏时间的推移，孢子菌属（）呈现先减少后增加的趋势（早期9.63%，中期9.14%，后期14.93%），unclassified Tremellales（早期4.22%，中期9.75%，后期8.01%）、unclassified Sordariomycetes（早期4.06%，中期1.21%，后期1.63%）和unclassified Nectriaceae（早期5.57%，中期0.32%，后期0.57%）同样表现出类似的趋势，相对丰度较低的伞形菌属（）、青霉菌属（）、顶头孢霉属（）、曲霉属（）和镰刀菌属（）也是如此。维什尼亚科齐马菌属（）在贮藏期间表现出“过山车”式的急剧变化（早期0.39%，中期20.75%，后期3.47%），说明其在贮藏中后期可能受到其他菌群的竞争，相对丰度较低的囊担菌属（）表现出先升高后降低的平缓趋势变化。枝孢菌属（）随着贮藏时间的延长一直升高（早期1.61%，中期10.65%，后期11.96%），相对丰度较低的大疱菌属（）和链格孢菌属（）同样表现出逐渐升高的趋势，表明这些菌群有着稳健的生存方式。与枝孢菌属相反的是，unclassified Fungi、丝状杆菌（）和红酵母菌属（）呈现出逐渐下降的趋势。中叶菌属（）虽然在贮藏早、中期比例相对很低（0.01%、0.02%），但到贮藏后期占比（5.88%）突然升高，似乎表明贮藏后期的条件更有利于其生长。

图5 基于属水平的真菌组成Fig.5 Fungal community composition at the genus level

2.3.2 基于属水平的细菌组成分析

如图6 所示，在贮藏早期，微小杆菌属（）为绝对的优势菌群（57.12%），随着贮藏时间的延长，其菌群相对丰度逐渐下降（中期36.15%，后期15.46%）。丰度持续升高的是叶绿体，其从早期的10.89%一路升高至后期的36.48%，后续的讨论中将会说明这种现象。假单胞菌属（）在贮藏早期相对丰度为20.96%，但在中期急剧下降至0.55%，后期升高至3.66%，表示其生长环境曾发生了剧烈变化。节杆菌属（）表现出先升后降的趋势（早期0.13%，中期8.96%，后期4.30%），嗜单胞菌（）也是如此（早期0.54%，中期0.12%，后期3.81%）。不动杆菌属（）则表现出先降后升的趋势（早期3.93%，中期1.73%，后期4.94%）。微杆菌属（）、金黄杆菌属（）、根瘤菌属（）、鞘脂单胞菌属（）、糖化杆菌属（）、动性杆菌属（）和足杆菌属（）均表现出逐渐升高的相对丰度，其中微杆菌属和金黄杆菌属在贮藏后期的相对丰度分别达到了5.14%和5.25%。鞘脂杆菌属（）和芽孢杆菌属（）的相对丰度仅在贮藏中期分别达到了1.27%和1.02%，其余时间均小于1%。

图6 基于属水平的细菌组成Fig.6 Bacterial community composition at the genus level

如图7所示，细菌多样性分布中，以微小杆菌属、叶绿体和假单胞菌属为A组，其他菌群为B组，相对丰度累加统计分析显示，A组在3 个贮藏时间分别为88.97%、72.27%和55.59%，B组的值分别为11.03%、27.73%和44.41%。若排除叶绿体的干扰，将微小杆菌属和假单胞菌属归为C组，则在3 个贮藏节点它们的值分别为78.08%、36.71%和19.11%。B、C两组数据显示出了明显的此消彼长的趋势。

图7 不同菌群累加占比分析Fig.7 Changes in relative abundance of different bacterial groups

3 讨论

菜心是我国特产蔬菜，在南方地区广泛种植并常年出口国外。近年来，菜心消费市场逐渐扩大，延长其保鲜期也成为研究热点。冷藏是人们经常使用的保鲜手段，有研究发现冷藏条件能够抑制菜心中微生物的活动，延缓菜心腐烂过程，但随着贮藏时间的延长，腐烂现象时有发生。不同抑菌剂对于微生物的抑制作用是特异且有限的，明确菜心贮藏期间优势菌或致腐菌的种类，有助于相关抑菌剂的开发。

真菌菌群多样性研究中，汉纳酵母属多为酵母形态，有时会呈现出菌丝或假菌丝状态，表示其可能存在侵入性生长。韩雨茜等发现汉纳酵母与环境pH值变化呈正相关，较低的pH值可能会抑制其生长。菜心含有丰富的水分、维生素、可溶性糖等营养物质，这为汉纳酵母属的生长提供了有利的生存条件。维什尼亚科齐马酵母属在贮藏中期相对丰度急剧增大，表明贮藏早、中期的营养物质非常有利于其生长。而在贮藏后期，其相对丰度又急剧降低，一方面可能是由于贮藏后期菜心茎部切口处的营养物质变得缺乏，另一方面可能是其他菌群的存在抑制了该菌群的生长。枝孢菌属呈现出了一直升高的趋势，表明其有持续扩大生长的能力。在许多研究中，枝孢菌属都是主要的致腐菌群，例如柚果面斑点病、水煮类罐头变质、卷烟霉变等均有枝孢菌属的身影，推测该菌群可能也会导致菜心腐败，不过这需要更多的实验数据支持。

细菌菌群多样性研究中，微小杆菌属曾多次被从不同的环境样本中分离得到，它们的生存温度可以覆盖－12～55 ℃。本研究中，微小杆菌属的相对丰度随着贮藏时间的延长持续降低，表明其面临着较为严峻的竞争压力。将贮藏期间波动较大的微小杆菌属、叶绿体及假单胞菌属排除后，贮藏早期其他菌群的相对丰度为11.03%，而到贮藏后期，这些菌群的相对丰度陡然升高到了44.41%，推测这可能是导致微小杆菌属持续降低的原因。此外，大量真菌对营养物质的消耗可能也导致了这种现象的产生，但考虑到多数细菌相对丰度在贮藏后期不降反升，前一种推测可能更能反映真实情况。假单胞菌属具有较强的致腐能力，但在贮藏后期其相对丰度仅为3.66%。相反地，节杆菌属、不动杆菌属、微杆菌属和金黄杆菌属在贮藏后期的相对丰度均高于假单胞菌属的值，而且它们的扩大趋势还在升高。根瘤菌属可能是采摘过程中从菜田携带而来，但其相对丰度一直保持在较低水平。

蓝细菌门虽然在本研究的细菌菌群中一直存在，但通过数据库比对，结果显示它们在属分类学水平上均为叶绿体。已有研究发现蓝细菌能够进入更高级的物种体内共生，进而产生基因转移，此外还有研究者认为叶绿体其实就是内共生的蓝细菌。因此笔者认为此次测序结果中存在较高比例的叶绿体可能是植物组织中的叶绿体干扰，而非真正的蓝细菌门。叶绿体的“污染”一直是研究者所要面临的挑战，很多通用的16S rDNA扩增引物都与叶绿体的16S rDNA具有同源性，这往往导致了非特异结果的产生。随着贮藏时间的延长，菜心切口处会有越来越多的腐烂植物组织，这些组织在取样过程中无法被较好去除而最终被带到高通量测序环节，可能是导致叶绿体相对丰度越来越高的原因。

4 结论

通过对不同贮藏时间的菜心进行高通量测序分析，明确了其中的微生物菌群组成及相对丰度变化趋势，共鉴定出真菌3 个门、22 个属，细菌5 个门、16 个属。在门水平上，真菌优势菌群均为担子菌门、子囊菌门和unclassified Fungi。细菌优势菌群从早期的厚壁菌门和变形菌门转变成了中、后期的厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。在属水平上，真菌的优势菌群为汉纳酵母属和孢子菌属，细菌的优势菌群为微小杆菌属。枝孢菌属和假单胞菌属是最可能导致菜心腐败的菌群，且二者的相对丰度趋势也在随着贮藏期的延长而升高。有研究表明多种酵母菌具有抑制致腐病原菌生长的能力，因此汉纳酵母属和维什尼亚科齐马菌属的存在，可能抑制了枝孢菌属和假单胞菌属的生长，进而有利于菜心贮藏期的延长，这需要后续实验数据的支持。回顾整个贮藏期，真菌的多样性一直高于细菌，似乎说明菜心切口处的生长环境更有利于真菌生长，而真菌菌群的竞争优势大于细菌菌群也是另一种可能。但考虑到菜心生长过程中的地域环境区别及采后转运过程的物流环境差异，菜心采后贮藏期的微生物多样性还需要更多实验数据佐证。而部分与土壤有密切联系的微生物菌群的确定，还需要土壤微生物学的相关数据支持。因此后续对不同地域菜心生长及转运过程微生物多样性的分析，将有助于人们更好理解菜心冷藏过程中的微生物多样性的变化规律，促进广谱性更强的抑菌试剂的研发及应用。