微量成分形成的反胶束对亚麻籽油氧化稳定性的影响

王新天，陈洪建，李晓雯，彭登峰，陈亚淑，邓乾春

（中国农业科学院油料作物研究所，农业农村部油料加工重点实验室，油料脂质化学与营养湖北省重点实验室，湖北 武汉 430062）

亚麻籽油是我国主要食用油脂之一，是-亚麻酸的良好来源（约60%）。-亚麻酸作为一种以植物资源为主的-3多不饱和脂肪酸，能够作为前体在体内合成具有更高营养功效的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，具有绿色安全、原料易得、受众广泛等突出优势。亚麻籽油不仅含有甘油三酯，还含有游离脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯、磷脂、植物甾醇等具有表面活性的微量成分。这种两亲性微量成分可以吸附到油水界面，当浓度高于其临界胶束浓度时，由于疏水作用而自发聚集，在油脂中形成反胶束。这些微量成分形成的反胶束可以在油脂中产生油水界面，影响脂质氧化产生的极性物质以及水溶性金属离子的物理分配，进而影响油脂的物理及氧化稳定性。因此，亚麻籽油中内源性微量成分形成的反胶束对食用油的稳定性及货架期有重要影响。

生育酚作为一种天然的脂溶性维生素，是植物油中最主要的天然抗氧化剂。但在贮藏过程中生育酚氧化生成具有表面活性的氧化生育酚，它们可以降低油的界面张力，导致氧气转移到油中，从而促进脂质氧化。反胶束可改变化学反应的微环境，作为有效的纳米反应器，影响抗氧化剂的抗氧化效应，改变植物油体系的稳定性。反胶束可以将抗氧化剂、极性氧化产物向油水界面迁移，并影响抗氧化剂的分解以及对金属离子的还原能力，从而增强/降低抗氧化剂有效性。亚麻籽油中微量成分形成的反胶束以及和生育酚的组合对亚麻籽油热稳定性及氧化稳定性的影响还知之甚少。在存在反胶束的天然油脂体系中，对反胶束与抗氧化剂的调控将直接影响油脂稳定性，这为富含-3多不饱和脂肪酸油脂的稳态化控制提供了新的策略与途径。

为探究亚麻籽油中微量成分形成的反胶束对亚麻籽油体系稳定性的影响，通过测量油酸、二酰基甘油（diacyl glycerol，DAG）、1,2-二油酰基卵磷脂（1,2-dioleoyl--glycero-3-phosphocholine，DOPC）和-谷甾醇在stripped亚麻籽油（stripped flaxseed oil，SFO）中的临界胶束浓度，研究其形成反胶束的能力。并进一步研究形成的反胶束对亚麻籽油热稳定性、氧化稳定性以及对生育酚抗氧化效应的影响，为天然油脂体系中微量成分形成的反胶束对油脂稳定性以及对抗氧化剂抗氧化效应的影响提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DOPC（CAS 4235-95-4，99%） 美国Avanti公司；-谷甾醇（CAS∶ 83-46-5，95%） 上海萌芽生物公司；甘油三酯（medium-chain triacylglycerols，MCT，CAS：538-24-9，96%） 印尼Miglyol公司；油酸（CAS 112-80-1，99%）、DAG（CAS 24529-88-2，97%）、-生育酚（CAS 10191-41-0，97%）、7,7,8,8-四氰基对苯二醌二甲烷（7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane，TCNQ，CAS 1518-16-7，98%）、丙醛（CAS 123-38-6，97%）、正己醛（CAS 66-25-1，98%） 美国Sigma公司；正己烷等有机试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

6980气相色谱仪 安捷伦（中国）有限公司；LC-6AD液相色谱仪 日本岛津公司；DU 800紫外分光光度仪 美国贝克曼库尔特公司；IKARV10D真空旋转蒸发器 德国艾卡公司；DSC Q2000差示扫描量热仪美国TA公司；743氧化诱导仪 瑞士万通公司。

1.3 方法

1.3.1 SFO的制备

根据Kiralan等的方法使用柱色谱法制备SFO。将100 g硅胶用总体积为3 L的蒸馏水洗涤3 次，并在125 ℃条件下活化12 h。然后依次用90 g硅胶、22.52 g活性炭和另外90 g硅胶填充色谱柱（内径5.0 cm，高50 cm）。将120 g油溶解在120 mL正己烷中通过该柱，用1 L正己烷洗脱。为了延缓过程中油脂氧化，收集的SFO保存在冰浴中并用铝箔覆盖。完成洗脱后，用真空旋转蒸发器在37 ℃除去正己烷，在氮气流下除去微量残留溶剂，得到SFO，并在－80 ℃贮藏，进行进一步分析。采用气相色谱仪和液相色谱仪测定SFO中微量成分的含量。

1.3.2 亚麻籽油基本成分测定

酸价、过氧化值、脂肪酸含量分别参照GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》、GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》、GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》的方法测定；生育酚含量按照AOCS Official Method Ce 8-89测定；植物甾醇含量按照黄颖等的方法测定。

1.3.3 临界胶束浓度测定

采用TCNQ增溶技术测定亚麻籽油中多种微量成分的临界胶束浓度。将MCT和SFO（3∶1，/，MCT作为一种不可氧化脂质）混合作为植物油体系。以下所述亚麻籽油均指MCT与SFO的混合油。将DOPC、-谷甾醇、油酸、D A G 及其混合物（物质的量比3.78∶0.97∶0.43∶2.25）添加到亚麻籽油中，测定范围为1～1 000 μmol/kg的临界胶束浓度。该比例旨在模仿商业精炼油中主要表面活性化合物的比例。将含有表面活性成分的油在室温下磁力搅拌24 h，然后按1 mg/g加入TCNQ，混合搅拌5 h。以2 000×离心20 min除去过量的TCNQ。使用紫外分光光度计在波长480 nm处测量吸光度。吸光度与表面活性成分浓度对数图的拐点即为临界胶束浓度。

1.3.4 贮藏样品制备

以低于（10 μmol/kg）和高于（500 μmol/kg）的临界胶束浓度，将微量成分（DOPC、-谷甾醇、油酸和DAG）的混合物添加到亚麻籽油中。为了研究抗氧化剂活性，在上述样品中分别添加10 μmol/kg-生育酚。所有样品在室温下磁力搅拌24 h，将样品（1 mL）等分到10 mL顶空样品瓶中，盖上PTFE/硅氧烷隔垫的铝盖，并在55 ℃避光贮藏。

1.3.5 氧化起始温度测定

采用差示扫描量热仪测定油的热特性。根据Oomah等的方法，并稍作修改。氮气流速为100 mL/min，称取8 mg油样品放置于铝盒中，空铝盒作为参考。将样品盒与参考铝盒置于热量计内部，从室温降低到10 ℃并维持10 min，然后在氧气存在下（100 mL/min），以2 ℃/min加热至350 ℃。测定重复3 次。

1.3.6 氧化诱导时间测定

参考AOCS Method CD12b-92方法，并适当修改。采用氧化诱导仪测定亚麻籽油氧化诱导时间。取3.00 g油样放置在玻璃反应试管中，在110 ℃条件下，向油脂中以恒定速率（20 L/min）通入干燥空气。测定油脂在达到恒定温度后的氧化诱导时间。抗氧化系数按下式计算：

式中：PF为抗氧化系数；IP’和IP分别为添加和不添加抗氧化剂的油脂的氧化诱导时间/h。

1.3.7 脂质氢过氧化物测定

采用紫外分光光度计法对亚麻籽油中氢过氧化物含量进行测定。取油样（200 μL）与2.8 mL甲醇-丁醇溶液（2∶1，/）混合，再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸铵和15 μL Fe。Fe是由0.132 mol/L BaCl（0.4 mol/L HCl配制）与0.144 mol/L FeSO等体积混合，取上清液得到。将混合物涡旋，室温孵育20 min，在波长510 nm处用紫外分光光度计测量吸光度。以异丙苯氢过氧化物为标准物制得标准曲线，测定氢过氧化物含量，单位为mmol/kg。

1.3.8 次级氧化产物丙醛、己醛测定

采用气相色谱结合固相微萃取技术分析植物油体系中丙醛、己醛含量。取1 mL乳液于10 mL顶空瓶中，压盖密封。将固相微萃取纤维头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）通过压盖膜插入并暴露于顶空瓶上部。55 ℃磁力搅拌，纤维头充分吸取挥发性物质10 min，将纤维头转移至气相色谱进样口解吸5 min后进行测样。进样口温度240 ℃，分流比1∶5；挥发性物质使用DB-5色谱柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm）进行分离，柱温箱、进样口、检测器温度分别为40、240 ℃和300 ℃，柱温箱升温程序：40 ℃保持6 min，以5 ℃/min升高至60 ℃，最后以30 ℃/min升高至280 ℃并以该温度保持2 min。分别使用丙醛、正己醛为外标对乳液中的丙醛、己醛含量进行定量。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 SFO中微量组分含量

为更准确研究微量成分及其形成的反胶束对油脂稳定性以及抗氧化剂活性的影响，首先将市售亚麻籽油经硅胶-活性炭-硅胶色谱柱制得SFO，除去本身含有的微量成分以及抗氧化剂。由表1可以看出，亚麻籽油中主要植物甾醇为-谷甾醇（（142.35±0.49）mg/100 g），富含-亚麻酸（54.59%）及油酸（20.64%）。与市售亚麻籽油相比，使用色谱柱法制备的SFO呈无色透明状，主要脂肪酸组成没有变化，-谷甾醇、菜油甾醇和环阿屯醇含量显著降低，而豆甾醇、燕麦甾醇、极性酚类化合物（磷脂和生育酚）等被完全脱除。

表1 经硅胶-活性炭-硅胶色谱柱后亚麻籽油中成分含量变化Table 1 Changes in the composition of flaxseed oil after adsorption on silica gel-activated carbon-silica gel column

2.2 微量组分在亚麻籽油中的临界胶束浓度

植物油体系中存在微量水时，当表面活性成分达到一定浓度时，会发生自聚集形成由单层表面活性剂分子稳定的纳米级水核，表面活性剂的极性基团延伸到水核中，脂肪链延伸到脂质介质中。表面活性分子开始聚集的浓度即为临界胶束浓度。本研究采用TCNQ增溶技术测定了各种微量成分在亚麻籽油中的临界胶束浓度。由图1可以看出，DOPC的临界胶束浓度为125 μmol/kg，其值比Kittipongpittaya等在55 ℃测定的数值（40 μmol/kg）大，可能是因为本研究在室温下测得，磷脂的临界胶束浓度随着温度的升高而降低。而油酸、-谷甾醇、DAG没有观察到典型的临界胶束浓度拐点，这与相关文献结果一致。尽管油酸，DAG和-谷甾醇能够集中在油水界面，但它们在本研究使用的浓度下不会形成反胶束。DOPC是亚麻籽油体系形成反胶束的重要组分。将DOPC、油酸、-谷甾醇、DAG四种微量成分按物质的量比混合（3.78∶0.97∶0.43∶2.25），测得临界胶束浓度为129 μmol/kg，与单一DOPC的临界胶束浓度相差不大。

图1 室温下DOPC、油酸、β-谷甾醇、DAG在油脂体系（MCT∶SFO=3∶1）中的临界胶束浓度Fig.1 Critical micelle concentrations of DOPC,oleic acid,β-sitosterol,and DAG in oil system (MCT:SFO=3:1) at room temperature

2.3 氧化起始温度与氧化诱导时间

将上述几种微量成分混合物以低于/高于临界胶束浓度加入到亚麻籽油中，测定其对亚麻籽油体系稳定性的影响及对生育酚抗氧化活性的影响。差式扫描量热法可在系统控制温度下，测量物质与参比物之间的能量差随温度的变化关系。通过DSC可以确定油脂的氧化起始温度，氧化起始温度越高，油脂的稳定性越好。油脂的氧化诱导时间是油脂到达氧化加速期之前的时期，常用诱导时间长短衡量植物油脂的抗氧化能力。抗氧化系数值越高说明抗氧化效应越好。由表2可知，与对照组相比，加入少量微量成分以及生育酚对其氧化起始温度（约132 ℃）以及氧化诱导时间（约0.41 h）没有显著影响，抗氧化系数达到0.9～1.0，说明无抗氧化性也无促氧化性。但当加入量超过临界胶束浓度，反胶束的形成使油脂的氧化起始温度从132.86 ℃降低到116.81 ℃，降低了12%。此时生育酚的加入并不能提高油脂的起始氧化温度（116.81 ℃）。且反胶束使油脂氧化诱导时间从0.42 h降低到0.28 h，降低了33%，抗氧化系数为0.67，说明具有促氧化效应。反胶束的形成使含有生育酚的亚麻籽油体系的抗氧化系数从0.98降低为0.73，表现出促氧化效应，降低了生育酚的抗氧化活性。

表2 不同油脂的氧化起始温度与氧化诱导时间Table 2 Oxidation initiation temperature and oxidation induction time of different flaxseed oil samples

由氧化起始温度及氧化诱导时间发现微量成分的少量加入对油脂稳定性以及生育酚的抗氧化活性无显著影响。添加量超过临界胶束浓度而形成反胶束后，其能明显降低油脂热稳定性，并降低生育酚的抗氧化效应。

2.4 脂质氢过氧化物

脂质氧化是导致不良风味和香气，降低营养价值以及食用油中潜在安全问题的主要因素。纯油体系中具有两亲性的微量成分在物理和化学上都会影响脂质的氧化机制。由图2可以看出，贮藏过程中，反胶束的形成促使亚麻籽油从透明状逐渐变为淡黄色，形成了共轭化合物，显示出促氧化活性。其余样品在整个贮藏期间呈无色透明状。

图2 油脂贮藏过程中外观变化Fig.2 Visual appearance of flaxseed oil during storage

如图3所示，与对照组相比，10 μmol/kg混合组分（低于临界胶束浓度）的加入没有改变脂质氢过氧化物形成的滞后期，其含量稍微增加。生育酚的加入能抑制油脂的氧化程度，但添加10 μmol/kg微量成分使生育酚的抑制作用减弱。当微量成分达到500 μmol/kg（超过临界胶束浓度）时，氢过氧化物浓度在初始阶段急速增加，几乎没有滞后期。与对照组相比，初级氧化产物生成量增加36%，说明反胶束表现出促氧化的作用。这与之前的研究一致，即由表面活性成分形成的反胶束降低了油脂的氧化稳定性。生育酚的添加能抑制油脂氧化，但反胶束的形成使其氧化产物浓度高于对照组，说明反胶束降低了生育酚的抗氧化活性（约33.6%）。这可能是因为反胶束的存在可以降低表面张力，增加氧气向油中的转移。且在游离脂肪存在的情况下，DOPC反胶束可能通过增加体系中游离脂肪酸的促氧化活性而对脂质氧化产生负面影响。此外，DOPC形成的反胶束还可以吸引金属离子和脂质过氧化氢到油水界面处加速脂质氧化速率，从而降低油脂的氧化稳定性。而反胶束限制了-生育酚对界面的可及性，很难聚集在油水界面，因此其抗氧化活性降低。

图3 油脂贮藏过程中脂质氢过氧化物的形成Fig.3 Lipid hydroperoxide formation in flaxseed oil during storage

2.5 次级氧化产物丙醛、己醛含量测定

如图4A所示，与对照组相比，10 μmol/kg混合组分（低于临界胶束浓度）的加入抑制了丙醛的生成，这可能是因为加入的DOPC具有一定的抗氧化作用，抑制初级产物向次级产物的转化，且生育酚的加入使抑制作用进一步增强。然而当添加量达到临界胶束浓度以上形成反胶束时，其形成丙醛的速率急速增加（含量增加约13%）。在含有生育酚的亚麻籽油中，反胶束的形成使氧化产物浓度显著增加，与反胶束体系接近，此时生育酚并没有表现出明显的抗氧化效果。因初级氧化产物氢过氧化物具有两亲性，聚集在油水界面，被过渡金属离子催化发生裂解反应，导致丙醛等次级氧化产物的生成。

图4 油脂贮藏过程中次级氧化产物丙醛（A）、己醛（B）的形成Fig.4 Propionaldehyde (A) and hexanal (B) formation in flaxseed oil during storage

如图4B所示，与丙醛的生成趋势相似，与对照组相比，生育酚的加入显著抑制己醛生成，并且低浓度混合组分（10 μmol/kg，低于临界胶束浓度）的加入对生育酚的抑制效应没有影响。当浓度达到临界胶束浓度以上形成反胶束时，己醛含量比对照组显著增加。在含有生育酚的亚麻籽油中，反胶束的形成亦会显著增加己醛的生成，表现出促氧化性。

反胶束的促氧化性可能与脂质氧化链传播过程存在传质现象有关，即一个颗粒的氧化产物传递到另一个颗粒中导致氧化的传播。一般水溶性物质通过水扩散传播，脂溶性物质只能通过颗粒碰撞-交换-分离来进行氧化传播，而在胶束存在的情况下，脂溶性物质可以通过胶束辅助转移从一个粒子扩散到另一个粒子，这个途径会比颗粒碰撞-交换-分离途径转移速率快很多，大大增加了脂溶性物质的传播速率。因此，除了氧化速率增加外，反胶束的存在可能改变了氧化产物的传递途径导致氧化速率大大增加。此外一些氧化产物的累积，例如脂质氢过氧化物，具有两亲性，其有可能与添加的微量成分竞争吸附到界面形成混合反胶束，但是其机理与反应机制还需进一步深入研究。

3 结论

测定了油脂中微量成分DOPC、油酸、-谷甾醇、DAG在SFO中的临界胶束浓度，并研究其形成的反胶束对亚麻籽油体系的稳定性以及对生育酚抗氧化活性的影响。结果发现DOPC是形成反胶束的重要组分，其临界胶束浓度为125 μmol/kg，而油酸、-谷甾醇、DAG在本研究使用的浓度下不会形成反胶束。与对照组相比，低浓度微量成分或生育酚对亚麻籽油体系的热稳定性没有显著影响，而微量成分会增加氧化产物浓度，并导致生育酚的抗氧化活性降低。反胶束的形成不仅降低油脂热稳定性及氧化稳定性，还降低了生育酚的抗氧化活性。一方面反胶束增加了游离脂肪酸的促氧化活性、将脂质氢过氧化物吸引到油水界面处加速脂质氧化速率，并限制了-生育酚对界面的可及性，很难聚集在油水界面，因此降低其抗氧化活性。另一方面反胶束还可能改变了脂质氧化链传播过程中物质的质量转移途径，进而加速脂质氧化，其机理与反应机制还需进一步深入研究。因此，控制反胶束的形成以及调控反胶束与抗氧化剂的组合对油脂稳定性具有重要意义，此研究为存在反胶束的天然油脂的稳定性调控提供了新思路。