短时高温好氧固态发酵对猪粪细菌群落结构的影响

张建龙，王亚妮，董乐辉，陈国忠*，姜琳琳，于馨，朱洪伟，郑维波，刘燕

试验研究

短时高温好氧固态发酵对猪粪细菌群落结构的影响

张建龙1,2,3，王亚妮1，董乐辉4，陈国忠1,2,3*，姜琳琳1,2,3，于馨1,2,3，朱洪伟1,2,3，郑维波1,2,3，刘燕1,2,3

（1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.山东省养殖环境控制工程实验室，山东 烟台；3.烟台市动物病原微生物与免疫学重点实验室，山东 烟台；4.山东益生种畜禽股份有限公司，山东 烟台）

为了研究畜禽粪便固态发酵前后微生物的变化，采用高通量测序技术，通过可操作分类单元分析、α多样性分析和物种组成分析，比较了猪粪短时高温好氧固态发酵前后的细菌群落组成，结果表明，发酵前后可操作分类单元总数分别为151个和126个，发酵后细菌群落多样性指数降低；发酵前相对丰度最高的分别是变形菌门59.48 %、拟杆菌门23.97 % 和厚壁菌门13.79 %，发酵后变形菌门和拟杆菌门分别减少至0.66 % 和1.00 %，而厚壁菌门增加至99.01 %，是发酵猪粪的优势菌群。本研究表明发酵后猪粪细菌群落多样性下降，抗生素抗性基因潜在携带者相对丰度降低，耐高温的有机质降解菌成为优势菌属，该研究对猪粪的资源化处理具有理论指导意义。

猪粪；高通量测序；细菌群落结构

集约化养殖导致畜禽粪便大量堆积，严重污染环境[1]。猪粪中含有大量的病原微生物，处理不当会导致对环境的二次污染[2]，暴发大规模的传染性疾病[3]。高温好氧堆肥可防止抗生素、抗生素抗性基因和抗性细菌从粪肥释放到农田土壤中[4]，改善土壤，提高农作物产量[5]。在高温好氧堆肥过程中微生物群落结构会发生显著的变化[6]。据报道Kato等[7]研究发现堆肥加速了牛粪中微生物群落的演替，使微生物丰富度下降的同时保持了微生物的多样性。Mao等[8]在研究堆肥前后猪粪中微生物的群落演替时发现厚壁菌门是嗜热阶段的绝对优势菌门，保持良好的微生物群落结构对猪粪堆肥起到了重要的指导性作用。

高通量测序技术能够通过从环境样本中直接获取总的DNA进行文库构建，从而提高测序效率[9]。本研究采用高通量测序的手段，对短时高温好氧固态发酵前后的猪粪进行微生物多样性分析，阐明短时高温好氧固态发酵前后猪粪细菌群落及物种的组成和相对丰度，进而可以确定猪粪发酵过程中的优势菌群，并通过对比总结出猪粪发酵前后细菌群落的演替规律，对猪粪发酵制备有机肥的资源化处理技术具有理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

猪粪由养殖户提供，发酵菌剂AT酵素由百威国际生物股份有限公司提供，花生壳粉采购自烟台市农贸市场。

1.2 方法

1.2.1 短时高温好氧固态发酵 将猪粪和花生壳粉按比例混拌均匀，碳氮比调节为25:1，控制含水量60 %，从不同位点随机采样5份，合并为1份，记为BEFE，作为发酵前样本。将物料加入百威高速发酵设备（百威国际生物股份有限公司）内，每1 t原料添加1 kg发酵菌剂，启动电源加热至50 ℃，启动搅拌每1 h转1圈，曝气速率为15 L/min。发酵10 h后加热至80 ℃ 维持1 h，加热至100 ℃ 再维持1 h，结束发酵，出料，在室外建成一个长2 m、宽1 m、高0.8 m的堆体，每天进行1～2次翻堆，腐熟6 d。当发酵结束后，在堆肥不同位点随机采集样品5份，合并为1份，记为AEFE，作为发酵后样本。每个样本采集3份，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 高通量测序 将样品送北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rRNA高通量测序，测序引物515F/907R，序列为515F：5'-GTGCCA GCMGCCGCGG-3'，907R：5'-CCGTCAATTCM TTTRAGTTT-3'，测序的区域是V4-V5区，测序平台是Illumina Miseq。

1.2.3 数据处理 对得到的测序原始数据进行筛选处获得优化序列，然后在97 % 的相似水平上进行可操作分类单元聚类分析，用Mothur软件计算得到丰富度指数、均匀度指数、香农指数、辛普森指数和覆盖率，利用R语言工具分析样本在不同分类水平上的群落结构。用SPSS统计软件进行单因素方差分析，显著性差异结果表示为<0.05。

2 结果

2.1 猪粪样品的测序质量

通过引物对样品的16S进行测定，猪粪发酵前后高通量测序总的碱基数分别为70 750和80 333，其中合并的碱基数分别为66 493和75 328，各占所测碱基总数的93.98 % 和93.77 %。从序列长度来看，所测序列长度分别在264 bp ～ 402 bp和265 bp ～ 394 bp之间，平均测序长度为372 bp和371 bp。

2.2 猪粪样品菌群的α多样性

2.2.1 稀释曲线 为了判断本样品测序数据量是否合理，笔者对发酵前后猪粪的测序序列进行随机抽样，然后利用稀释曲线进行评估。发酵后和发酵前的曲线随着测序深度的增加最终接近平台期趋于平稳，说明本次取样的合理性，测序深度已经基本覆盖样本中的所有物种。

2.2.2 群落多样性指数 香农指数和辛普森指数代表了微生物的多样性。由表1可以看出发酵后细菌群落的香农指数与辛普森指数相比于发酵前降低了，表明发酵后猪粪的物种多样性下降但是群落分布多样性却有微量的增长。发酵后的丰富度指数和均匀度指数明显低于发酵前，这说明发酵后的猪粪中物种丰富度显著降低。发酵前细菌可操作分类单元为151个，发酵后细菌可操作分类单元为126种，两种状态下都存在的为85种，表明发酵前后的细菌类别存在较大差异。

表1 群落多样性指数

注：*表示差异显著（<0.05）

2.3 细菌群落结构变化

2.3.1 在门水平的细菌群落结构 高通量测序结果表明（表2），发酵前猪粪细菌群落在门水平上的主要类群为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门，相对丰度分别为59.48 %、23.97 %、13.79 %、2.55 %。变形菌门是其优势菌门。发酵后厚壁菌门是优势菌门，并且占有绝对优势，相对丰度达到99.01 %。

表2 发酵前后细菌在门水平的相对丰度

表3 发酵前后细菌在属水平的相对丰度

2.3.2 在属水平的细菌群落结构 由表3可见，发酵前在属水平上相对丰度排名前7的菌属为不动杆菌属40.85 %、香味菌属17.58 %、毛球菌属7.88 %、橄榄杆菌属4.19 %、弧菌属3.65 %、假单胞菌属3.63 %、肠球菌属2.63 %。发酵后这7个属的相对丰度值都显著降低，尤其是优势菌属不动杆菌属在发酵后相对丰度仅为0.66 %，远低于发酵前。嗜热粪杆菌属、中度嗜热微菌属和中度嗜热厌氧菌属成为发酵后的优势菌属，占比分别达到66.95 %、7.41 % 和4.35 %。

2.3.3 细菌群落各分类单元占比差异 对发酵前后猪粪细菌群落各分类单元的分布差异进行了分析，发酵前细菌在纲、目、科、属中的分布广泛，发酵后则主要集中于厚壁菌门梭菌纲。发酵前猪粪中的细菌主要分布在变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，发酵后则是厚壁菌门占据绝对优势。对于厚壁菌门而言，发酵前仅有芽孢杆菌纲乳杆菌目的肉杆菌科、气球菌科和肠球菌科。发酵后的猪粪细菌群落中有芽孢杆菌纲乳杆菌目的肉杆菌科、肠球菌科、乳酸细菌科和芽孢杆菌目，以及梭菌纲的梭菌目和盐厌氧菌目。

3 讨论

（1）采用高通量测序技术研究了短时高温好氧固态发酵对猪粪细菌多样性的影响。样品的稀释曲线末端趋于平坦说明样本的测序数据量是足够的。发酵后猪粪中细菌的多样性下降，其原因在于短时高温好氧发酵的温度高于50 ℃ 甚至达到80～100 ℃，在此阶段大多数微生物因为耐热性较差而失活[10]，嗜热细菌生存下来成为优势菌群[8]。（2）通过种群结构分析，猪粪发酵前后细菌群落变化显著，发酵前厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是堆肥微生物区系中占主导地位的门类，发酵后厚壁菌门成为了丰度最高的优势菌门且占比超过99 %，该结果与王旭辉等[11]报道的牛粪堆肥过程中微生物的变化是一致的。动物粪便是人畜共患病原体的主要来源，其中的变形菌门是细菌中最大的门，含有大量的病原性菌种。发酵前变形菌门是猪粪细菌群落的优势菌门，符合畜禽肠道微生物菌落的一般规律。大多数病原菌在50 ℃ 以上24 h内就会被灭活，因此猪粪中的病原菌经过高温发酵后绝大部分被杀死，原来占优势的变形菌门在发酵后仅占细菌总数0.66 %。变形菌门中很多菌种是抗生素抗性基因的携带者，变形菌门丰度降低和抗生素抗性基因的消除具有一定的相关性[12-13]。发酵后厚壁菌门成为猪粪中的绝对优势菌群，其原因是多方面的。首先，厚壁菌门细胞壁的肽聚糖含量约在50 % ～ 80 %之间，细胞壁较厚具有较强的耐热性；其次，发酵菌剂大多为厚壁菌门菌种，其本身就是优势菌群；最后，厚壁菌门能利用现成可发酵的碳水化合物并参与纤维素外围侧链的初始定植[14]，同时分泌多种果胶酶来完成降解纤维素等难消化的碳水化合物的目的，发酵过程中加入的辅料是含有大量木质素和纤维素为主要成分的花生壳，对厚壁菌门具有促生作用。此外，猪粪中氮源含量高，而厚壁菌门具有能够利用氮源和促进氨基酸运输代谢的能力[15]，这也是厚壁菌门成为优势菌群的主要原因之一。（3）从属水平分析可知，发酵前不动杆菌属、香味菌属、毛球菌属、橄榄杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、肠球菌属7个相对丰度较高的菌属在发酵后都显著降低，嗜热粪杆菌属、中度嗜热微菌属和中度嗜热厌氧菌属成为发酵后的优势菌属。已有报道表明畜禽粪便中磺酰胺类抗生素抗性基因的相对丰度较高[16]，而不动杆菌属和假单胞菌属被认为是主要载体[17]，这两个菌属在发酵后丰度降低有利于抗生素抗性基因的消减，即有利于畜禽粪便的无害化。嗜热粪杆菌属、中度嗜热微菌属和中度嗜热厌氧菌属在纤维素和有机物的降解中起主导作用[18-21]，都属于嗜热菌，这可能是这三类菌高温发酵后在猪粪的微生物菌落中成为优势菌种的主要原因。（4）本研究对采用短时高温好氧固态发酵前后的猪粪样本进行了高通量测序，通过可操作分类单元分析、α多样性分析和物种组成分析发现：发酵后猪粪细菌群落物种多样性下降，变形菌门、拟杆菌门相对丰度降低，厚壁菌门相对丰度增加成为优势菌门，抗生素抗性基因携带者不动杆菌属和假单胞菌属相对丰度降低，耐高温的有机质降解菌嗜热粪杆菌属、中度嗜热微菌属和中度嗜热厌氧菌属成为优势菌属。发酵前后猪粪细菌群落结构的变化主要与发酵温度、辅料和发酵菌剂特性有关，短时高温好氧固态发酵能够有利于猪粪无害化处理。

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S852.6

A

1007-1733（2021）05-0001-04