HAAM支架复合兔BMSCs促进关节软骨修复的实验研究

贾海栋，李 毅

(河北省邯郸市中心医院骨一科 056000)

软骨主要分布于长骨末端，在关节运动过程中参与减震的作用[1]。关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，缺乏血管、神经纤维和淋巴管。关节软骨损伤是临床上比较常见的疾病，是导致关节疼痛和残疾的主要原因[2]。研究表明，美国每年有大约10万例的关节软骨损伤需要手术治疗[3]。由于软骨特殊的结构，氧气和营养物质的来源有限，因此当软骨发生损伤时，其自我修复能力十分有限。目前，软骨损伤的常用治疗手段主要有：物理治疗、药物治疗、手术治疗，常用的手术方式主要有微骨折术、骨髓刺激术、自体软骨细胞移植术等[4-8]。虽然其在临床上得到了广泛的应用，但是每种治疗方式都很难达到患者预期的期望。因此，急需寻求新的手段来修复软骨缺损。

组织工程技术的发展为临床很多疾病的治疗提供了新的思路，在软骨损伤的研究也取得了不错的成绩。组织工程技术包括三大核心要素：种子细胞，生长因子和支架材料[9]。目前常用的种子细胞主要是各种来源的干细胞，包括：骨髓间充质干细胞(BMSCs)[10]、脂肪MSCs[11]、外周血来源的MSCs[12]等。BMSCs是目前应用最为广泛的干细胞，已经证实其能够向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化[13-15]。

支架材料是组织工程技术的又一核心要素，其能够为种子细胞的生长、增殖、分化提供良好的微环境。HAAM支架来源于人胎盘的羊膜，通过将羊膜脱细胞处理制备而成。由于来源广泛、成本较低，且具有抗炎作用，HAAM支架作为一种天然生物支架材料已经广泛应用于组织工程技术[16-18]。因此，本实验的目的即探究HAAM支架复合BMSCs是否具有促进兔关节软骨修复的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年新西兰大白兔15只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1HAAM支架的制备

取下羊膜，无菌条件下转移至实验室超净台上，用磷酸盐缓冲液(PBS)多次冲洗，用剪刀剪成合适的大小置于玻璃皿中(上皮面朝上)，用含有乙二胺四乙酸(EDTA)浓度为0.25%的胰酶在37 ℃培养箱中消化30 min。取出后用细胞刮将消化下来的细胞刮掉。将脱细胞处理后的羊膜剪成适当的大小并平铺在6孔板中，用三抗对HAAM进行消毒约1 h，吸干三抗后用PBS冲洗数次并用紫外线再次消毒1 h，见图1。

A:分离胎盘上的羊膜；B:将羊膜用0.25%的胰酶消化；C:将脱细胞处理后的羊膜(HAAM)平铺在6孔板。

1.2.2BMSCs的分离培养

将新西南大白兔处死并进行消毒处理。切开皮肤，暴露股骨，将股骨取下置于PBS中。将双侧骨骺端截取，暴露骨髓腔。用5 mL注射器吸取PBS，用PBS反复冲洗骨髓腔，将骨髓全部冲洗出。800 r/min离心2 min，弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，然后接种到培养瓶，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，每2～3天换液。

1.2.3将BMSCs种植到HAAM支架上

将生长状态良好的P3代BMSCs以1×105/cm2的密度种植到预先制备好的HAAM支架上，隔天在普通倒置相差显微镜下观察BMSCs的生长情况，每2～3天更换培养基。

1.2.4鬼笔环肽染色

BMSCs种植到HAAM支架上后分别在1、3、7 d通过鬼笔环肽染色观察细胞在支架上的生长情况，鬼笔环肽染色主要是观察细胞的骨架。分别在1、3、7 d时选取在HAAM支架上生长情况良好的BMSCs进行鬼笔环肽染色，吸掉培养基，PBS清洗细胞；用4%的多聚甲醛室温固定10 min；再次用PBS清洗细胞；将配置好的鬼笔环肽工作液按照说明书剂量滴加到6孔板，室温避光孵育30 min；用PBS清洗3次；然后用DAPI复染细胞核，约30 s；再次用PBS清洗3次。荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5动物体内实验

所有动物在手术前以0.75 mL/kg的剂量静脉注射3%戊巴比妥钠进行麻醉。待麻醉起效后进行备皮、消毒铺巾，沿着左侧膝关节正中切开皮肤，充分暴露膝关节腔，用环钻在股骨滑车处钻一直径为3.5 mm,深度为3.0 mm的骨软骨缺损(见图2)。将15只新西南大白兔分为3组(每组5只)：空白对照组、HAAM组、HAAM+BMSCs组。复位髌骨，逐层缝合皮肤，伤口消毒，术后连续3 d肌内注射青霉素20万单位/只。术后3个月取关节标本，大体上观察软骨缺损处的修复情况并进行大体评分。

1.2.6组织学检测

将标本取下后立即用4%的多聚甲醛室温固定24 h，然后用EDTA脱钙液脱钙约2周，然后进行切片。首先将标本脱水处理，然后石蜡包埋后切片。切片成功后进行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝观察缺损处的修复情况。

1.2.7主要观察指标

BMSCs在HAAM支架上的生长情况及HAAM支架复合BMSCs对兔关节软骨的修复作用。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 BMSCs的形态

倒置相差显微镜下观察BMSCs的形态：P0代(原代)BMSCs多呈圆形或椭圆形贴壁生长；经过多次传代培养后BMSCs逐渐呈长梭形涡旋状贴壁生长;P3代BMSCs形态最为典型，呈明显的涡旋状贴壁生长，见图3。

2.2 鬼笔环肽染色

将BMSCs种到HAAM上后，再次分别在1、3、7 d后通过鬼笔环肽染色观察细胞在支架上的生长情况。结果显示：第1天，有少量的BMSCs在HAAM支架上生长，细胞的轮廓未发生明显的改变，说明HAAM支架的空间结构适合细胞的生长；第3天，BMSCs的数量明显增加，几乎呈倍数生长，说明BMSCs生长可能达到了对数期；第7天，BMSCs几乎长满整个HAAM支架，见图4。

2.3 体内实验结果

术后3个月，空白对照组缺损处未见明显的修复组织，仍可见缺损的存在;HAAM组可见缺损处有修复组织的填充，但是缺损处表面不光滑，与周围正常组织在色泽上有明显的差异;HAAM+BMSCs组修复组织几乎完全填满了的缺损处，且表面光滑，色泽与正常软骨相似，与正常软骨组织连接的边界几乎完全消失，见图5。对术后3个月的标本进行HE、甲苯胺蓝染色，观察各组软骨的修复效果。空白对照组HE染色显示缺损仍有较大的缺口存在，未见明显的再生组织，与正常组织交界明显；甲苯胺蓝染色呈阴性，说明没有软骨的再生，修复效果较差;HAAM组HE染色可见大量的新生组织，缺损处可见修复组织的填充，但是缺损处表面不光滑、不规则，与正常软骨组织差异明显；甲苯胺蓝染色染色呈弱阳性，虽然有部分的新生软骨的存在，但是其与正常的软骨有一定的差异;HAAM+BMSCs组HE染色结果显示缺损的关节软骨部分被大量的新生组织填充，几乎完全填满，并且与周围的软骨正常组织结构几乎相同；甲苯胺蓝染色呈强阳性，有大量新生软骨的存在，见图6。

3 讨 论

关节软骨损伤的修复是临床上的一大难题，尽管目前有很多种治疗软骨损伤的方法，但是其远期效果均不是很理想。目前常用手术方式包括：自体软骨细胞移植、骨软骨移植、微骨折技术等[19-23]。虽然自体软骨细胞移植在前瞻性随机试验中取得了好的结果，但也存在一些问题，如需要两次手术和高治疗成本[19-21]；骨软骨移植在短期内具有良好的效果，但是与自体软骨细胞移植相比，骨软骨移植术后10年的失败率(55%vs.17%)明显增加[22]；微骨折的短期症状改善效果较好，但术后2年可见纤维组织再生，而且有临床症状复发的情况出现[23]。

本实验通过组织工程技术的方式从支架材料和种子细胞方向入手，旨在为关节软骨的修复提供新的思路。支架材料具有负载种子细胞、为细胞提供生长微环境的作用，是组织工程的一大关键。因此，本实验通过使用一种天然的支架材料来探究其对软骨损伤修复的作用。人羊膜是一种透明的薄膜，具有丰富的细胞外基质成分，主要有透明质酸、纤连蛋白、胶原蛋白等。由于其具有抗炎性、来源广泛等优点，已经广泛应用于基础研究甚至临床。HAAM通过人羊膜脱细胞处理而成，其细胞外基质仍被保留，具有较好的生物相容性。相关实验研究也证实了HAAM支架具有良好的生物相容性[24]。此外，也有研究证实了HAAM对软骨的损伤修复具有一定的促进作用，这都为本次实验提供了理论基础。本实验采用了一种简单、快速的方法成功制备了HAAM支架，虽然之前也有相关研究报告通过不同的方法将人羊膜脱细胞处理，从而制备HAAM支架，但是本实验通过对以前的方法进行改进，缩短了胰酶对新鲜羊膜的作用时间，从而最大限度地保留了羊膜的细胞外基质成分，为细胞的种植提供了较好的微环境[25]。HAAM支架较其他支架而言具有独特的优势，例如：来源广泛、价格低廉、不存在道德伦理争议、制备过程简单等。因此，本实验选取了操作简单、价格低廉、来源广泛的方法成功制备并提取了组织工程的支架材料和种子细胞。将种子细胞种植到支架材料上通过扫描电镜和鬼笔环肽染色观察到细胞在支架上生长较好，随着培养时间的延长细胞在支架上不断增殖，说明支架材料适合细胞的生长。体内实验通过将种子细胞在HAAM支架上培养后移植到兔股骨滑车软骨缺损处，观察其对软骨损伤的修复效果。结果提示：HAAM有一定的软骨修复效果，但是HAAM+BMSCs的修复效果较HAAM组有明显的差异。分析产生该结果的原因可能有以下几点：(1)HAAM支架能够为缺损处细胞的募集和生长提供较好的微环境，从而有利于软骨的修复；(2)HAAM支架复合BMSCs对软骨损伤修复有明显作用，说明BMSCs在软骨损伤的修复的过程中扮演着重要的角色；(3)HAAM支架可能对关节腔内的干细胞及软骨下骨的BMSCs有一定的招募作用，使周围的干细胞迁徙到受损的部位从而起到一定的修复作用。当软骨损伤后，关节内或周围的BMSCs立即调动，参与内源性修复[26]，具体是何种BMSCs发挥最明显的作用目前还不能明确，虽然有研究已经证实损伤后的骨髓BMSCs是软骨损伤后修复的主要细胞来源[26]。但可以肯定的是软骨损伤后BMSCs对其损伤的修复有一定的作用。因此，本实验支架负载细胞组其修复效果最好，说明BMSCs确实发挥了作用。后续的实验还需进一步通过HAAM支架负载不同的间充质来观察其对软骨损伤的修复效果。

本实验未设置单纯的BMSCs组，因为单纯将细胞移植到受损的关节软骨缺损处很难保证细胞在局部发挥作用，可能在关节液的影响下流失。本实验有以下几点不足：(1)本实验观察的软骨修复时间为3个月，软骨损伤修复是一个缓慢的过程，因此，后续实验还需进一步延长观察时间，从远期观察HAAM复合BMSCs对软骨损伤修复的作用；(2)本实验仅仅观察了一个时间点的软骨修复情况，软骨损伤修复是一个动态的、逐渐变化的过程，因此，还需要进一步完善相关实验，设置多个时间点动态的观察软骨的修复情况；(3)本实验虽然证实了HAAM+BMSCs具有促进软骨修复的作用，但其具体机制不明确，还需要进一步的研究明确其机制。