IGF-1促进肺泡上皮细胞衰老致肺纤维化进展的分子机制研究*

赫 琪,肖伟利,曹银芳,刘佳谊,梁子红△

(1.内蒙古自治区人民医院医学检验科,呼和浩特 010017;2.内蒙古医科大学附属医院血液科,呼和浩特 010017)

特发性肺纤维化普遍发病年龄在60岁以上,属于难治性疾病,目前尚无有效的治疗手段阻止其进展[1]。肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells,AECs)在持续微损伤环境下自身修复功能下降致肌成纤维细胞聚集是肺纤维化进展的核心事件[2]。研究表明在肺纤维化中AECs修复功能下降与细胞衰老有关,然而目前AECs衰老的原因、机制不明[3]。研究[4-5]发现：胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)是一类自然生长激素,在促进机体生长、发育中发挥重要作用,通过激活下游磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K) 及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;别名AKT),最终引发细胞衰老[4-5]。衰老后的AECs通过衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)释放转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)促进AECs向肌成纤维细胞转化及增加胶原的合成,最终加重肺纤维化[6-7]。笔者推测：IGF-1信号通路活化可能是AECs衰老致肺纤维化进展的重要机制,若能对IGF-1信号通路活性进行精准调控，有可能恢复AECs的修复功能及抑制肺纤维化进展。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57小鼠,体重18～25 g,6～8周龄,购于内蒙古医科大学实验动物中心,动物合格证号NMGYKDX(蒙)2020-0534。根据随机数字表法将小鼠分为2组,每组6只,分别为对照组(盐水组)、博来霉素(BLM)组。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株购于ATCC细胞库；A549细胞用含有RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素混合溶液培养并置于37 ℃孵箱中进行孵育。

1.2.2主要实验试剂

BLM购自海正辉瑞制药有限公司；IGF-1购自北京索莱宝生物公司。HE染色试剂盒和戊巴比妥钠购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA纯化试剂盒购自QIAGEN；其他生化试剂均购自北京索莱宝生物公司。

1.2.3肺纤维化小鼠模型建立

充分麻醉后,向小鼠气管内一次性滴入实验用量的 BLM(5 mg/kg)构建肺纤维化模型。向对照组小鼠气管内滴入等量的生理盐水,记为第0天,常规自由饮食；第21天腹腔注射1.5%戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠,并分别收集两组小鼠的肺组织。取部分肺组织于4%多聚甲醛固定24 h后,制作石蜡切片,用于HE染色和Masson染色；剩余肺组织经液氮速冻后,保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4小鼠肺组织免疫组织化学染色

石蜡切片用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡,不同浓度乙醇(100%、95%、80%、70%)脱水后,用微波抗原修复法对石蜡切片进行抗原修复。修复完成后滴加工作封闭山羊血清对样本进行封闭(时间30 min)。封闭结束后孵育一抗过夜。次日依据北京中杉金桥公司的过氧化物酶标记羊抗兔/鼠试剂盒说明书,分别滴加SP试剂(链霉亲和素-过氧化物酶),进行DAB显色、苏木素复染等操作，并在显微镜下观察评分。IGF-1主要表达于腺体细胞的细胞质及细胞膜,以细胞质及细胞膜出现淡黄色、黄色、棕黄色为阳性，按阳性细胞比例计分:<10%为0分,10%～30%为1分,>30%～60%为2分,>60%为3分;按染色强度计分:无色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。将两项计分相乘,0、1～3、4～6、7～9分别记录为-、+、++、+++。这些得分也可以表述为≤3分为表达阴性(-),>3分为表达阳性(+)。切片均经2名有经验的病理科医师在双盲情况下分别阅片。

1.2.5细胞免疫荧光

将正常培养的A549细胞株传代至24孔板爬片中。PBS清洗3次后,4%多聚甲醛固定、0.1%Trition破膜后用山羊血清进行封闭,孵育一抗(4 ℃冰箱过夜)。次日孵育二抗,时间2 h。DAPI染核、封片，并于激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白的表达情况。

1.2.6IGF-1检测

ELISA法测定小鼠肺组织中 IGF-1的水平。

1.2.7mRNA检测

根据实验分组将不同处理方法的A549细胞用细胞裂解液进行裂解并提取总RNA,用紫外分光光度计测定各组RNA浓度；严格按照TaKaRa公司的反转录试剂盒操作步骤进行操作,以此获得反转录后的cDNA；检测各组细胞样本中PI3K、AKT的mRNA的表达水平(PI3K:F-GAAAAGTTTGGCCGGTTCCG、R-GCAGTCAACATCAGCGCAAA;AKT:F-CTTTCGGCAAGGTGATCCTG、R-GTACTTCAG GGCTGTGAGGA;GAPDH:F-TGACTTCAACA GCGACACCCA、R-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA)。

1.2.8细胞免疫印迹

将上述所得的各组处理后的组织样本用RIPA细胞裂解液提取总蛋白并进行蛋白定量检测。选取各组蛋白20 μg进行上样,SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和转膜。结束后根据蛋白相对分子质量准确裁剪目的蛋白条带,并用0.4% 明胶进行封闭,时间30 min。封闭结束后孵育一抗,4 ℃孵育过夜。次日,PBST 缓冲液清洗3次,随后用HRP标记的抗人源 IgG二抗室温孵育1.5 h,再次用PBST缓冲液清洗,最后曝光并对其进行分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 IGF-1在BLM小鼠肺组织中广泛表达

HE、Masson染色结果显示：与对照组的肺脏病理相比,BLM小鼠肺脏间质中细胞数量增多、蓝染的胶原纤维增加。免疫组织化学结果显示：与对照组(-/+)相比,BLM小鼠肺脏中IGF-1的表达(+++)明显上调,见图1。

图1 正常小鼠肺组织与BLM小鼠肺组织中IGF-1的表达(×200)

2.2 IGF-1可诱导肺泡上皮细胞发生衰老现象

IGF-1(10 ng/mL)刺激A549细胞72 h后,β-半乳糖染色(SA-β-gal)结果发现：与对照组相比,IGF-1刺激组衰老阳性的细胞数量明显增多(P<0.05)。免疫荧光实验结果发现：与对照组相比,IGF-1刺激组红色荧光表达的P21、P16明显上调(P<0.05)，见图2。

A：SA-β-gal染色检测各组衰老阳性细胞的数量；B：免疫荧光检测各组P16、P21表达变化。红色荧光代表P16、P21。

2.3 IGF-1上调了细胞衰老表型中TGF-β1、MMP-9的表达

ELISA法对A549细胞培养基进行了检测,结果发现：与对照组相比,IGF-1刺激A549细胞72 h后的培养基中,TGF-β1、MMP-9的表达明显上调(P<0.05)，见图3。

图3 ELISA法检测各组TGF-β1、MMP-9的表达

2.4 IGF-1致肺泡上皮细胞出现转分化(EMT)现象

免疫印迹实验结果发现：与对照组相比,IGF-1诱导A549细胞衰老72 h后,A549细胞蛋白中的N-Cadherin、α-SAM表达明显上调，见图4。

图4 免疫印迹检测各组A549细胞蛋白中的N-Cadherin、α-SAM的表达变化

2.5 细胞衰老中出现了IGF-1/ PI3K/AKT信号通路的活化

实时定量PCR结果发现：与对照组相比,IGF-1诱导A549细胞72 h后,PI3K、p-AKT的表达明显上调，见图5。

图5 qRT-PCR检测各组A549细胞中的PI3K、p-AKT的mRNA表达水平变化

3 讨 论

临床资料的流行病特点显示，特发性肺纤维化的发病人群普遍以老年人为主,且与AECs衰老明显相关[8]。但AECs发生衰老的原因及具体机制不明。所以本研究的创新点是发现了IGF-1信号通路的活化导致AECs衰老后发生IPF的重要原因。

AECs在慢性损伤等病理条件下具有很强的再生及修复能力,但IPF发生时AECs丧失了自身的修复功能并启动了后续致纤维化的生物学效应[9]。细胞衰老理论认为随着年龄的增长,细胞会发生损伤,影响了自身的修复功能,由此可见修复功能下降的AECs与细胞衰老明显相关[10]。但细胞衰老不仅仅是年龄增加的结果,更多的是在慢性损伤等病理条件下共同作用的结果。基础研究发现：AECs遭遇慢性损伤时,会过度释放IGF-1,激活IGF-1/PI3K/AKT信号通路,一方面释放炎症因子,形成氧化应激反应；另一方面IGF-1会加速细胞生长速度,使细胞发生功能性改变,最终发生细胞衰老[11]。虽然不少学者报道了IGF-1是致纤维化进展的关键细胞因子,但在肺纤维化中IGF-1是否是造成AECs衰老的重要原因，以及具体机制是什么并不清楚。所以在本研究中利用 BLM小鼠模型观察IGF-1在肺纤维化的表达情况,同时利用IGF-1对AECs进行诱导,观察AECs衰老的现象。在本研究中发现了BLM小鼠肺组织中不仅存在IGF-1的广泛表达,还发现IGF-1诱导AECs 72 h后,AECs发生了明显的细胞衰老现象。这些发现均说明了IGF-1是导致AECs衰老及肺纤维化发生的重要原因。

SASP是细胞衰老后发生纤维化生物学效用的重要标志[12]。文献报道了IGF-1/ PI3K/AKT信号通路活化后会释放TGF-β1、MMP-9,恰巧这些细胞因子均是IPF进展的重要蛋白[13-14]。TGF-β1可促进成纤维细胞增殖活化及胶原合成,使未成熟的成纤维细胞演变成肌成纤维细胞[15]。MMP-9则可以活化炎症信号通路，促进炎症细胞在肺间质中的积聚[16]。本研究IGF-1诱导小鼠AECs衰老后,除了引起细胞培养基中 TGF-β1、MMP-9表达增加外,AECs还发生了EMT现象。这更加充分说明了IGF-1致AECs衰老后发生的EMT现象是肺纤维化进展的关键机制。

PI3K/AKT信号通路活化依赖于上游细胞因子IGF-1的释放[17]。PI3K/AKT信号通路的活化不仅仅是纤维化发生的重要信号通路,也是细胞衰老的重要信号通路[18]。所以本研究进一步利用IGF-1建立AECs衰老模型,检测下游信号通路关键蛋白PI3K、AKT的表达,结果发现IGF-1诱导AECs衰老72 h后,PI3K、AKT的表达明显上调。

IPF是多个蛋白介导的多条信号通路网络样活化过程,在AECs衰老中是否存在其他信号通路的活化及IGF-1信号通路的活化是否比其他信号通路活化更为重要,均需要进一步研究。本研究的发现有助于了解及预防衰老相关性疾病,为精准研发IPF药物提供了临床转化的理论基础。