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人羊膜对创面愈合的促进作用

2009-02-24范金财蔡国斌

中国美容医学 2009年1期
关键词:甘油创面细胞

梁 婧 范金财 蔡国斌

有效的创面覆盖是创面愈合过程中的重要环节。创面覆盖物种类繁多,可分为常规敷料、生物敷料和合成敷料等几大类,具有保护创面、预防感染、防止体液和营养物质丢失、促进创面愈合等特点。羊膜作为生物敷料中较重要的一类,其应用最早始于1910年,Davis首先把胎膜(羊膜+绒毛膜)作为手术替代材料来进行皮肤移植取得成功。1913年Stem和Sabella分别报道了用羊膜来治疗皮肤烧伤和皮肤溃疡。此后羊膜被广泛应用于各种手术:用于眼科,治疗角膜缺损、结膜炎症及缺损,效果良好[1-2];用于烧伤等创面的覆盖,具有诱导上皮再生、减少渗出物、减轻疼痛等功能;用于颅脑、腹腔和腰椎手术,可起到组织修补和预防粘连的作用。羊膜以其来源广泛、取材方便、生物相容性好、抗原性低等优点而被誉为“神奇之膜”。Ravishanker等[3]强调了在发展中国家医院建立“羊膜库”的重要作用。1998年在华沙建立了中央羊膜组织储备库。本文就有关羊膜的生物学特性、制备、贮存,对创面愈合的促进作用及其机制,以及羊膜的生物学改良等方面综述如下。

1概述

1.1 羊膜的生物学特性:羊膜是从细胞滋养层衍化而来,位于胎儿绒毛膜的表面,为光滑、无血管、无神经、无淋巴的双层透明薄膜,厚约0.02~0.5mm,是人体中最厚的基底膜。由5层构成:①羊膜上皮:大部分为单层立方上皮,有合成、分泌和沉积基底膜和细胞外间质成分的能力;②基底膜:由狭窄的无细胞网状纤维构成,厚度不一,含Ⅰ型胶原纤维网、层粘连蛋白和硫肝糖蛋白;③致密层:薄而致密,无细胞,由网状纤维组成;④成纤维细胞层:是羊膜厚度的主要组成部分,由成纤维细胞和网状纤维构成;⑤海绵层:由波浪状网织纤维构成[4]。组织学及电镜观察,见羊膜内层是来自内胚层的上皮组织,包括数层鳞状上皮细胞,但也可以见到成型的低立方形细胞;在近脐根部有时可见较厚的复层鳞状上皮区,因而证实妊娠早期的羊膜具有与胎儿皮肤极相似的结构[5],认为羊膜可能具有与皮肤相同的防御保护和屏障功能,在局部能起到保护创面不受细菌侵入,减少感染机会的作用。

1.2 羊膜的制备及贮存

1.2.1 羊膜的制备:严格按照供体医学标准,无菌条件下取新分娩的健康剖宫产孕妇胎盘。产前母体行血清学检查排除人体免疫缺陷病毒、乙肝病毒和丙肝病毒,排除巨细胞病毒和梅毒螺旋体等感染,孕妇产道无淋球菌或衣原体感染病史,无其他传染性疾病和恶性肿瘤病史。将胎盘置于超净工作台中,用含抗菌药物的PBS溶液反复冲洗以去除表面的凝血块,然后钝性分离将羊膜与绒毛膜组织分开,去除羊膜基底面残留的绒毛膜和血管组织,生理盐水反复冲洗后剪成所需大小方块,浸泡于0.1%庆大霉素溶液或1∶1000新洁尔灭中15min后即可用于创面。

1.2.2 羊膜的贮存:自从Kim等首次应用4℃、体积分数100%的甘油保存的羊膜移植重建兔眼表获得成功后,保存羊膜在临床中的应用已非常广泛。羊膜的贮存方法很多,大致有以下几类:

1.2.2.1 DMEM/甘油深低温保存法:将羊膜片放入装有灭菌DMEM/甘油液(DMEM/甘油体积比为1∶1)的羊膜容器(经高压消毒的中性硅玻璃瓶),封闭瓶口置于-80℃冰箱保存。用前室温自然解冻,并在生理盐水中浸泡复水。

1.2.2.2 纯甘油4℃保存法:将羊膜片放入装有消毒纯甘油的羊膜容器,24h后取出羊膜片,转移到另一纯甘油瓶中,封闭瓶口抽出残留气体后置于4℃冰箱中保存30天后使用。用前在生理盐水中浸泡复水。

1.2.2.3 无水酒精保存法:将羊膜片放入装有体积分数为75%酒精的羊膜容器中,24h后取出转移到另一装有体积分数100%酒精的容器中,4℃或室温保存备用,可贮存半年,但要注意保持酒精浓度。用前在生理盐水中浸泡复水。

1.2.2.4 真空干燥保存法:将羊膜片放入羊膜容器中,低温真空干燥1h,加盖蜡封后置于4℃冰箱中保存备用。用前在生理盐水中浸泡复水。

目前我国基层医院应用最为广泛的是纯甘油4℃保存法,此方法简便易行,经济安全,100%甘油作脱水和冷冻保护剂,可减轻冷冻对细胞的损伤,同时甘油对微生物还有杀灭作用;DMEM/甘油深低温保存法因为需要采取深低温冷冻设备,在我国应用较少,除了甘油的保护作用外,DMEM保存液中还含有供细胞生长的各种氨基酸、微量元素、各种维生素及缓冲系统的平衡液,且其Na+浓度与羊水较接近[6];无水酒精保存法来源方便,可消毒防腐,但可使组织脱水、蛋白凝固变性,是无活性保存法;真空干燥保存法使蛋白质凝固变性,也是无活性保存,但此法不需要液体,携带方便。

1.3 羊膜的敷治方法

1.3.1创面处理:首先要处理创面,如溃疡边缘瘢痕增生明显或有老化的肉芽组织应将其切除;创面肉芽水肿严重者,可采用3%~5%高渗盐水湿敷,消除肉芽水肿;创面感染严重者,可根据创面的细菌培养结果,选用有效的抗生素湿敷;对于骨外露面积较大者,可行骨钻孔或咬除部分骨皮质以利于肉芽生长。

1.3.2羊膜的贴敷:彻底清创后以75%酒精消毒周围皮肤,1‰新洁尔灭消毒创面,按创面大小剪取羊膜。新鲜羊膜可直接贴敷,用酒精贮存的羊膜经外用盐水清洗后敷于创面,避免酒精对创面的刺激。羊膜应平整敷于创面,赶尽羊膜下气体使羊膜与创面紧贴。羊膜边缘应超出创缘约1cm。创面渗出较多时,可贴敷带孔羊膜。羊膜贴敷后可暴露创面,也可以无菌敷料包扎。大部分创面在1~2天左右干燥结痂,可不必更换,直至创面愈合羊膜自行脱落。如膜下积脓,应及时清除后重新贴敷羊膜。羊膜干燥后注意观察创面远端的血液循环情况。

2羊膜对创面愈合的促进作用及作用机制

2.1 加快创面上皮化及愈合进程:动物实验及临床应用效果显示,羊膜覆盖创面后,上皮组织从创面周边的皮缘向内爬行,创面肉芽组织生长明显,生长速度明显较对照组快。其原因可能与以下因素有关:①创面覆盖羊膜后,膜下既没有大量积液,减少了创面感染因素,又阻止了水分蒸发,保护了创面上残留的上皮细胞,从而促进了创面的愈合[7];②羊膜细胞内含有丰富的次级溶酶体,能使炎症局部的肥大细胞分泌组胺潜在释放因子,使局部血管扩张,改善局部的血流灌注,改善创面局部缺血状况;③感染的控制和局部血液循环的改善为创面愈合提供有利条件;④羊膜含有纤维粘连素、层粘连素、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖,以及其他一些蛋白多糖大分子和一些细胞生长因子(Koizumi,NJ等研究发现,羊膜含有高水平的EGF、KGF、HGF和bFGF等多种生长因子),有促进细胞黏附、迁移、增值和分化等重要功能,阻止上皮细胞凋亡;⑤另外,基底膜上的Ⅳ型胶原可延长接种其上的上皮细胞生长寿命,并保持其表型[8]。

2.2 减轻或消除创面疼痛:羊膜覆盖创面后,具有明显的疼痛减轻或消失作用。应用羊膜代替表皮,可起到物理屏障作用。贴敷创面后隔绝与外界的接触,减轻创面浅表神经暴露因冷热或机械性刺激引起的疼痛,还可减少水分蒸发,防止创面枯干。此外如上文所述,羊膜细胞内含有丰富的次级溶酶体,能使炎症局部的肥大细胞分泌组胺潜在释放因子,通过使局部血管扩张改善局部的血流灌注,改善创面局部缺血状况,避免创面组织坏死引起的疼痛。同时羊膜内含有活性成分如神经营养因子和神经递质, 能营养神经、促进神经纤维再生。Mligiliche等[9]将羊膜细胞外基质制成管状诱导周围神经再生,用以修复鼠坐骨神经缺损,发现合适管径的羊膜管能诱导坐骨神经再生。张琪等[10]应用复合自体Schwann细胞的羊膜基底膜卷修复大鼠坐骨神经缺损,也证实了羊膜可以引导神经再生和延伸。

2.3 保护创面,减少创面渗出:创面贴敷羊膜后,浆液性渗出减少,创面周围水肿减轻或消失,原色泽苍白的创面逐渐转为红润,羊膜逐渐形成干燥的羊膜痂,患者略有紧绷感,创面愈合后痂皮自行脱落,表面完整。在整个创面愈合过程中,羊膜发挥着一个半透膜的作用,既避免了体液大量丢失,又有效防止了膜下积液形成,使创面保持一定湿度。这是以羊膜的结构特点为基础的:电镜下,见羊膜上皮细胞表面有许多微绒毛,基底部有细胞突起伸入基底膜形成足突样结构。细胞突起与基底膜之间通过半桥粒结构形成紧密连接,微绒毛和桥粒连接共同在羊膜上皮细胞之间组成复杂的迷路型管道系统,成为沟通羊膜腔与羊膜基质的通道。同时,羊膜具有许多酶参与甾体激素代谢,减轻创面水肿;羊膜上皮中活性物质如IL受体拮抗剂、IL-10和基质金属蛋白酶抑制剂等促进移植区多形核中性粒细胞凋亡,利于炎症吸收[11];某些可溶性细胞因子如抗新生血管化蛋白抑制新生血管长入,减少免疫细胞来源等。

2.4 抑制细菌生长,预防创面感染:Rejzek等[12]通过实验观察到羊膜覆盖能抑制创面的细菌生长,其抑菌作用比同种异体皮大1 000倍,并认为羊膜对烧伤创面的抗感染能力主要是由于羊膜覆盖创面造成一个闭合环境,防止了细菌污染,同时使机体本身的防御能力得以在局部发挥最大的作用。羊膜孔隙数平均为2×106/mm2,孔径为0.3~3.4μm,可允许水分和一些小分子物质通过,而一般细菌不易通过直径﹤5μm的孔隙[13],使其成为保护创面的天然屏障。另表明,羊膜内含有抑菌因子、次级溶酶体、产生甾体类激素的酶等活性物质,可有效抑制细菌生长;羊膜上皮在细菌细胞壁的脂多糖或肽聚糖刺激下能产生β-防御素,β-防御素可能与天然免疫有关[14]。

2.5 减少创面瘢痕形成:经随访,羊膜覆盖后创面愈合处瘢痕增生不明显,弹性及韧性良好,柔软耐磨。有研究表明,炎症是刺激瘢痕形成的原因[15]。羊膜通过不同的途径抑制创面炎症反应,从而起到抗纤维化,减少瘢痕的作用:羊膜可以抑制白细胞介素表达、调整炎性趋化因子表达、诱导多核白细胞凋亡;通过抑制转化生长因子(transforming growth factor TGF)β的mRNA表达来抑制成纤维细胞的活性,减少瘢痕形成。基于下调TGF-β2信号系统降低瘢痕粘连的原理, Shah等[16]发现在切口周围注射中和TGF-β2的抗体时能有效抑制瘢痕形成。此外,羊膜上皮细胞含有抗炎因子,可促进炎性细胞凋亡,抑制原有胶原过度分解,避免移植后炎性反应的发生[17-19]。Tseng等研究发现,羊膜可诱导TGR、P51,P52和P53等在创伤愈合中与成纤维细胞活动有关的信号下调,从而达到抗纤维化效果。Adinolfi等用免疫荧光技术证明人羊膜上皮细胞膜上不表达HLA-A、B、C及DR抗原,也不表达TGF-β2微球蛋白,而且体外羊膜上皮细胞与异基因淋巴细胞共培养时未见细胞毒T细胞产生,因而抗原性弱,同种异体移植排斥反应小。羊膜含有抗新生血管化蛋白,对新生血管有一定的抑制作用。

3羊膜的生物学改良

近年来,很多学者通过生物工程技术对羊膜进行生物学改良,改变羊膜结构(去羊膜上皮细胞或改变上皮细胞性质)及成分(吸附特殊药物,使羊膜固有化学成分发生变化),在保持羊膜基本生理特性的同时赋予其更多的生物功能,取得一定成果。

3.1 生物复合型羊膜:以带有活性组织细胞为主要特征的羊膜,主要用于各种原因所致的经单纯药物治疗或传统羊膜移植术无效的严重创面。羊膜以其无毒性,良好的生物组织相容性,生物可降解性及降解可调节性,以及不引起机体免疫排斥反应,具有可塑性和一定的机械强度等生物学特性,成为组织工程中附载种子细胞的理想生物材料。羊膜附载骨髓间充质干细胞、表皮细胞、角质形成细胞、人胚胎干细胞和成纤维细胞等种子细胞的皮肤组织工程材料,在实验和研究中已得到一定应用。

3.2 药学羊膜:含有特定药物成分的羊膜细胞外基质,根据所含药物种类不同,又可细分为单一药物型羊膜和复合型药物羊膜。羊膜基底膜富含胶原纤维和网状纤维,交织排列成网状,网孔间隙0.5~15.0μm,能容纳大量药物分子,可吸附药液作为“药库”。羊膜可自行降解,在较长时间内逐步释放药物,维持局部有效的药物浓度,成为良好的膜控半定量释药系统。

3.3 生物复合型药学羊膜:可称其为超级羊膜。既载有活性组织细胞如角膜缘干细胞或多能干细胞,又含有特定药物成分如抗生素或抗排斥药物。

综上,羊膜以其来源广泛,利用方便,柔韧性好,易延展,免疫组织相容性好,能有效支持附载种子细胞并能诱导其分化,符合伦理学原则等优点成为生物敷料及组织工程材料的理想选择。随着材料工程、生物工程、组织工程和基因工程等技术的不断发展,克服羊膜质脆、易碎不耐压以及易溶解等不足;寻找更能保持羊膜活性的人工羊膜制备及贮存方法;构建更加适于并能有效附载种子细胞及其分化所需生物环境的组织工程载体材料;通过基因修饰等技术对种子细胞进行有针对性的改良等都成为可能。总之,羊膜的生物学改良将得到更广泛的研究和应用,羊膜上皮细胞,羊膜活性成分及羊膜外基质与不同的功能细胞、生物制剂、活性药物相互组合应用,与新的技术完美结合,使各成分发挥其最大效应而构建复合型生物羊膜,应用于创面的修复与皮肤缺损的治疗,必将组织修复带入一个新的领域。

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[收稿日期]2008-10-21[修回日期]2008-12-30

编辑/张惠娟

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