c-myc与CENPA在结直肠癌表达的相关性及其临床病理学价值*
2022-06-01陆伟杰高小姣史春桃
陆伟杰,高小姣,史春桃,韩 玮,程 杰△
(1.江苏大学附属昆山医院普外科 215300；2.江苏大学附属昆山医院病理科 215399；3江苏省无锡市锡山人民医院普外科 214000)
结直肠癌已经成为全球发病率第三的恶性肿瘤,严重影响这人类的生命健康,因此,发掘新的肿瘤标志物对结直肠癌早期筛查及诊疗具有重要意义[1-2]。癌基因c-myc定位于染色体8q24,由于该基因的激活可使细胞无限增殖,获得永生化功能,故其在肿瘤发生和进展中起关键作用[3-4]。着丝粒蛋白A(centromere protein A,CENPA)是由位于染色体2p23的CENPA基因所编码的促癌蛋白,目前研究表明,其异常高表达是导致人类癌症基因组不稳定性的重要因素,其中包括8q24/Myc区域相关的基因不稳定[5-6]。因此,本研究通过数据库及临床样本,旨在分析c-myc与CENPA在结直肠癌中的相关性及临床病理学价值。
1 材料与方法
1.1 数据库分析
利用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)和GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)检索CENPA与c-myc在结直肠癌组织与正常组织中的表达差异,并应用Pearson相关性分析明确二者的相关性。利用PROMO数据库(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)预测人类组织中可能作用于CENPA与c-myc启动子(序列从-2 500到0)的转录因子。
1.2 标本来源
筛选出2016年1月至2019年12月于江苏大学附属昆山市第一人民医院行肠癌根治术的86例具有完整的临床病例资料的标本,标本来源患者平均年龄为(66.05±14.06)岁,其中男42例,女44例。每例标本具有癌组织与癌旁正常组织,且病理结果均经两名以上病理医师确认。
1.3 主要试剂
免疫组织化学试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；抗c-myc兔多克隆抗体(ab32072)和抗CENPA兔多克隆抗体(ab45694)购自Abcam公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.4 免疫组织化学法(SP)
本实验采用SP法检测,c-myc抗体稀释度为1∶200,CENPA抗体稀释度为1∶300。通过对石蜡切片脱蜡水化和抗原修复,用免疫组织化学试剂盒试剂A与B依次作用切片,进行封闭；滴加一抗工作液,过夜孵育后再依次使用试剂C与D；经DAB显色后,复染脱水封片。
1.5 染色评分方法
染色强度评分和阳性细胞计数评分相乘结果记为免疫组织化学染色评分(immunoreactive score,IRS)。按染色强度记分：无色、黄色、棕色、褐色分别记为0、1、2、3分,按阳性细胞所占百分比1%～100%分别记为1～100分。根据c-myc和CENPA的IRS值,将≥100定为阳性,反之为阴性。
1.6 统计学处理
采用SPSS 20.0和Graphpad 6.0软件进行统计学分析。连续变量采用成组配对t检验,组内变量采用配对χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。c-myc与CENPA的相关性采用Pearson相关性分析。
2 结 果
2.1 c-myc与CENPA在结直肠癌与正常组织中的表达相关性
Oncomine数据库分析可得,c-myc与CENPA在结直肠癌组织中的基因表达水平明显高于正常组织；不仅如此,共表达分析中发现,二者在结直肠正常组织与结直肠癌组织中的表达呈正相关。
在GEPIA数据库中,笔者同样发现,在275例结肠癌组织和92例直肠癌组织中,CENPA与c-myc表达均明显高于正常组织,且二者在结直肠癌组织中表达呈正相关(R=0.26,P<0.001),见图1。
A:CENPA在结直肠癌组织与正常结直肠上皮组织中的表达差异；B:c-myc在结直肠癌组织与正常结直肠上皮组织中的表达差异；C:CENPA与c-myc在结直肠癌组织中的表达相关性。
在86例结直肠癌组织及癌旁正常组织的免疫组织化学中可以发现,c-myc与CENPA均位于细胞核内,在胞质与胞外基质中无未见明显表达(图2A)；且二者在结直肠癌组织中的表达水平均显著高于癌旁正常组织(tc-myc=9.103,P<0.001；tCENPA=7.913,P<0.001；图2B)；相关性分析中同样发现,两者在结直肠癌组织中的表达呈正相关(P<0.001,图2C)。
A:c-myc(左)与CENPA(右)分别在正常结直肠上皮组织和结直肠癌组织中的免疫组织化学染色结果(×400)；B:c-myc(左)与CENPA(右)分别在正常组织与癌组织中免疫组织化学染色评分比较；C:c-myc与CENPA在癌组织中免疫组织化学染色评分的相关性分析。
2.2 c-myc与CENPA表达与结直肠癌临床病理参数的关系
根据二者在结直肠癌组织中的表达情况,进行分组(≥100为阳性,反之为阴性),c-myc阳性组有37例,阴性组49例；CENPA阳性组40例,阴性组46例。c-myc与淋巴结转移(P=0.004)和TNM分期(P=0.013)呈正相关,而与年龄、性别、肿瘤大小以及病理分级无关(P>0.05)；CENPA阳性者,则仅与更高的病理分级相关(P=0.027)，见表1。
表1 c-myc与CENPA在结直肠癌中的表达与临床病理参数的关系
续表1 c-myc与CENPA在结直肠癌中的表达与临床病理参数的关系
2.3 c-myc与CENPA阳性在结直肠癌临床病理中的作用
c-myc与CENPA均为阳性患者共25例,c-myc阳性、CENPA阴性有12例,c-myc阴性、CENPA阳性有15,二者均阴性有34例。c-myc与CENPA均为阳性与更高的病理分级(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.012)及更晚的TNM分期(P=0.024)密切相关,而与年龄、性别及肿瘤大小无明显相关。
表2 结直肠癌中c-myc、CENPA均为阳性与临床病理参数的关系
续表2 结直肠癌中c-myc、CENPA均为阳性与临床病理参数的关系
2.4 PROMO数据库预测作用CENPA与c-myc启动子的转录因子
PROMO数据库中预测发现,有81个转录因子可能作用CENPA启动子,有80个转录因子可能作用c-myc启动子,其中,有AR、TCF-4、YY1等71个转录因子可能共同作用CENPA与c-myc启动子，见图3。
图3 PROMO数据库预测结果
3 讨 论
结直肠癌是源于结直肠腺上皮的恶性肿瘤,其发病主要与生活方式、环境、和饮食结构及遗传因素有关[7]。在这些因素的综合作用下,癌基因的异常激活成为恶变的重要因素。一直以来,寻找和挖掘新的生物学指标成为学者们攻克结直肠癌的主要研究方向之一。然而,越来越多的研究发现,单一的生物学指标并不能完全解释结直肠的临床病理学参数[8]。因此,多基因的联合检测成了早期筛查与预后评估的关键。
c-myc作为一种经典的癌基因,参与Akt/mTOR、Wnt/β-Catenin等多个信号通路的调控,促进肿瘤的发生与发展[9-10]。因此,c-myc高表达普遍存在于多种恶性肿瘤中[11-13]。本研究同样发现,相比于正常组织,c-myc在结直肠癌组织中表达明显增高,且与淋巴结转移和较晚的TNM分期密切相关。不仅如此,c-myc又是一种转录因子调控多种基因,尤其在肿瘤细胞中上调多种癌基因的表达水平[14]。因此,通过检测c-myc调控的相关基因的表达,在临床病理学诊断中或许有一定的辅助作用。
着丝粒结构是染色体结构和功能高度特化的重要组件,参与细胞有丝分裂及增殖过程[15]。CENPA则是着丝粒特异组蛋白,是细胞周期相关的重要指标,该基因的缺失会造成细胞染色体异常分离,进而减缓生长[16]。文献表明,该基因在多种癌组织中的表达明显升高,提示其参与肿瘤的发生发展[17]。本研究同样发现,CENPA高表达于结直肠癌组织,且与病理分级呈正相关；从Oncomine与GEPIA数据库中可以发现,c-myc与CENPA在结直肠癌组织中的表达存在正相关关系。这一正相关关系在本研究收集的86例结直肠癌病例中也得以证实。另外,二者均表达于细胞核内,为此,本研究又将病例分为两组,即c-myc、CENPA均为阳性组与其他表达组,从而发现,二者均为阳性组与病理分级、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。可见,二者联合在临床病理学参数的评估价值优于任意一种。然而,c-myc与CENPA之间的相关调控机制,还需开展深入的基础实验来确认。PROMO数据库预测出有AR、TCF-4、YY1等71个转录因子可能共同作用CENPA与c-myc启动子。这些转录因子在结直肠癌发生发展中具有促进作用,尤其是TCF-4,在Wnt/β-catenin信号异常激活中起到重要作用[18]。而c-myc又能通过多种途径形成正反馈环路,进一步刺激自身表达上调[19]。根据PROMO数据库预测和相关性分析结果,笔者推测,很可能就是因为c-myc的这种反馈调控促进CENPA的表达上调,并使二者表达呈正相关。但是,这些推论还需后续体内外实验的验证。
综上所述,c-myc与CENPA在结直肠癌组织中表达均明显升高,且呈正相关；c-myc与淋巴结转移和TNM分期呈正相关,而CENPA仅与病理分级呈正相关；二者均为阳性与更高级的病理分级、淋巴结转移及更晚的TNM分期密切相关。c-myc与CENPA的启动子可能同时都受到AR、TCF-4、YY1等71个转录因子的调控作用。
