杨梅枝条醇提物对A375细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制

郑园园，俞浙萍，张淑文，李有贵，孙 鹂，郑锡良，戚行江，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华321004； 2.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州310021； 3.浙江省农业科学院 蚕桑与茶叶研究所，浙江 杭州 310021)

杨梅(Sieb et Zucc.)是我国南方著名的特产水果，已有2 000多年的栽培历史，在浙江、福建、云南等地均有广泛种植。杨梅经济寿命长，果实可鲜食，可加工成果酒、蜜饯，提取色素等，叶可绿化园林，提取精油等；根系发达，可保持水土，与放线菌共生形成根瘤起到固氮作用等。杨梅除了具有较高的经济、生态、工业价值，其在药用保健方面潜力巨大。杨梅栽培过程中，果农每年均需要对树体进行不同程度修剪，修剪后的枝条被弃置或焚烧，造成资源浪费与环境污染。

杨梅具有较高的药用价值，其果实、叶片、核仁等不同部位含有丰富的花色苷、类黄酮、酚酸、不饱和脂肪酸等物质，在抗氧化、抗炎症、抑菌、抗肿瘤、预防和治疗心血管疾病等方面具有一定药效作用。杨梅树皮中含三萜类、单宁类、二芳基庚烷类、黄酮类等活性物质，其成分与杨梅枝条接近；研究发现，杨梅树皮提取物中的主要特性成分杨梅素和杨梅苷，对人肝癌细胞HEPG2、人前列腺癌细胞PC-3和人肺腺癌细胞A549具有一定的抑制作用。

目前，针对杨梅提取物的药物活性研究主要集中在果实、叶、核仁、树皮等组织，还未见杨梅枝条提取物的相关研究。此外，杨梅提取物已在多种肿瘤的研究中表现出较好的抗癌活性，但在黑色素瘤研究方面还未见报道。黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤，在皮肤癌中死亡率最高，发病率在全球范围内呈上升趋势。手术切除肿瘤、放疗、化疗，以及免疫和分子靶向疗法常用于治疗不同时期的黑色素瘤。尽管晚期黑色素瘤的免疫治疗和靶向治疗已取得重大进展，但仍有相当比例患者的治疗效果不显著或出现多种副作用。基于上述原因，目前利用植物天然产物及其衍生物治疗人恶性黑色素瘤，已成为当下研究重要热点之一。

本研究以人恶性黑色素瘤A375细胞为研究对象，利用超声波辅助乙醇提取法获得杨梅枝条醇提物MRBE，分析不同浓度MRBE处理对A375细胞抑制率、细胞周期、细胞凋亡的影响，以期揭示其对A375细胞增殖和凋亡的影响，及潜在作用机制。本文充分利用杨梅修枝后产生的废弃枝条，开展杨梅枝条醇提物的生物活性研究，将为杨梅枝条的深度加工利用和药用价值研究提供较好的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用杨梅枝条由树体修剪后获得，取自浙江省兰溪市马涧镇下杜村杨梅基地(119°37′14′E，29°18′34″N)，收集茎粗1～2 cm东魁杨梅枝条，样品保存于浙江省农业科学院园艺研究所超低温冰箱，-70 ℃保存。人恶性黑色素瘤A375细胞购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。

试验所需的相关试剂如下：RPMI-1640培养基，GIBCO BRL公司；FBS，杭州四季青生物材料研究所；胰蛋白酶(Trypsin)、PBS(Phosphate Buffer Solution)，Amresco公司；MTT[3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide]、DMSO(Dimethyl sulfoxide)、PI(Propidium Iodide)，Sigma公司；Annexin V-EGFP/PI试剂盒，Thermo Fisher科技公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒，TaKaRa公司；qRT-PCR引物，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

试验所需的仪器设备分别如下：DFY-600粉碎机，温岭市林大机械有限公司；KQ-250E型超声仪器，昆山市超声仪器有限公司；R-502旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；96孔和6孔培养板，Corning公司；CO培养箱，Thermo公司；TS100型倒置光学显微镜，Nikon公司；Infinite M200酶标仪，TECAN公司；Cytomics FC 500 MCL流式细胞仪，Beckman Coulter公司；Real-time PCR仪器，ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 MRBE制备

将修剪后的杨梅枝条去除叶片等部分，进行清洗、剪短，60 ℃烘干至质量不变，粉碎研磨后在室温下用70%乙醇超声提取4～5次，将提取液静置24 h后用直径9 cm快速定性滤纸(孔径80～120 μm)过滤，反复旋蒸后静置，冷冻干燥后获得MRBE用于后续研究。

1.3.2 细胞培养

利用RPMI-1640培养基进行人恶性黑色素瘤A375细胞的培养，在培养基中加入10% FBS、1%青霉素和链霉素，并置于5% CO、37 ℃培养箱中培养。

1.3.3 MRBE对人恶性黑色素瘤A375细胞的抑制实验

取对数生长期的A375细胞，经胰酶消化后，调整细胞浓度至1×10mL，取100 μL细胞悬液加入96孔培养板，培养24 h使其贴壁去培养基。按Yu等的方法，设置空白组(不含细胞)，以不加MRBE处理的细胞为对照组，不同浓度MRBE处理(100、200、300、400 μg·mL)的细胞为实验组，加入100 μL培养液，每组设置6孔，培养48 h。加入20 μL的5 g·LMTT溶液，继续培养4 h，去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，酶标仪570 nm波长处测定吸光度，重复3次。按下式计算细胞抑制率：

抑制率(%)=

1.3.4 PI检测A375细胞周期分布

以不加MRBE处理的细胞为对照组，200、400 μg·mLMRBE处理的细胞为实验组，培养48 h，按Zhong等的方法进行试验。利用流式细胞仪和MultiCycle软件检测分析，重复3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI检测A375细胞凋亡

以不加MRBE处理的细胞为对照组，200、400 μg·mLMRBE处理的细胞为实验组，培养48 h，按Zhong等的方法进行试验。利用流式细胞仪和MultiCycle软件检测细胞凋亡情况，分别调查早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死细胞情况，重复3次。

1.3.6 实时荧光定量PCR

以不加MRBE处理的细胞为对照组，200、400 μg·mLMRBE处理的细胞为实验组，分别培养6 h和48 h。按Yu等的方法，将处理后的样品500 r·min离心10 min，弃上清，用预冷的PBS清洗细胞。按照天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA试剂盒提取RNA，反转录成cDNA。qRT-PCR总反应体系为20 μL，扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40次循环。以-作为内参基因。采用2法计算基因表达水平，设置3次重复。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 MRBE浓度对A375细胞增殖抑制率的影响

MTT实验结果如图1所示，不同浓度MRBE(100、200、300、400 μg·mL)处理A375细胞48 h后，对细胞增殖均表现出显著的抑制作用，抑制率分别达到(3.31±0.06)%、(16.42±0.06)%、(32.37±0.12)%、(49.46±0.17)%(图1-A)，抑制率随处理浓度的升高而增加，呈剂量依赖效应关系。同时，随着MRBE处理浓度的升高，细胞胞质皱缩，逐渐变小变圆，贴壁性减弱，细胞间隙增大(图1-B)，表明MRBE在体外可以抑制A375细胞增殖。

A，不同浓度MRBE处理A375细胞48 h后的抑制率；B，不同浓度MRBE处理A375细胞48 h后的细胞形态情况。*表示0.01

2.2 MRBE处理对A375细胞周期的影响

200、400 μg·mLMRBE处理A375细胞48 h时测定细胞周期，结果如图2所示。200 μg·mLMRBE处理的G/G期细胞比率[(79.34±1.15)%]与对照组[(82.64±1.15)%]无显著差异，S期细胞比率[(16.64±0.58)%]极显著高于对照组[(8.83±0.12)%]，G/M期细胞比率[(4.01±0.06)%]极显著低于对照组[(8.53±0.12)%]。400 μg·mLMRBE处理，G/G期细胞比率[(86.39±1.73)%]与对照组[(82.64±1.15)%]无显著差异，S期细胞比率[(8.71±0.58)%]与对照组[(8.83±0.12)%]无显著差异，而G/M期细胞比率[(4.90±0.12)%]极显著低于对照组[(8.53±0.12)%]。上述结果表明，400 μg·mLMRBE处理对A375细胞S期具有显著的阻滞作用。

A，PI流式细胞术分析不同浓度MRBE对A375细胞周期的影响；B，不同细胞周期阶段的细胞数量百分比。

2.3 MRBE处理对A375细胞凋亡的影响

如图3所示，200、400 μg·mLMRBE处理A375细胞48 h，早期凋亡率从对照组的(0.83±0.06)%分别提高至(23.27±0.58)%(200 μg·mL处理)和(25.68±1.15)%(400 μg·mL处理)；晚期凋亡率从对照组的(3.07±0.58)%分别提高至(21.51±0.29)%(200 μg·mL处理)和(10.76±0.58)%(400 μg·mL处理)；坏死细胞则由对照组的(0.96±0.12)%分别提高至(4.24±0.12)%(200 μg·mL处理)和(7.44±0.23)%(400 μg·mL处理)。结果初步表明，200 μg·mL和400μg·mLMRBE处理均可显著诱导和促进A375细胞凋亡。

A，Annexin V-PI双染流式细胞术检测不同浓度MRBE对A375细胞凋亡的影响，左下为正常细胞，右下为早期调亡细胞，右上为晚期调亡细胞，左上为坏死细胞；B，不同类型细胞数量百分比。

2.4 MRBE对A375细胞周期和细胞凋亡相关基因的影响

细胞的生长、发育、增殖和凋亡等生命过程，涉及关键信号通路上一系列基因的表达调控作用。为进一步明确MRBE对A375细胞周期和细胞凋亡的影响，筛选了部分关键基因开展qRT-PCR试验。基因表达情况如图4所示，200、400 μg·mLMRBE处理A375细胞48 h后，KIP家族成员21表达极显著上调，细胞周期蛋白相关基因、、、表达显著下调；细胞周期蛋白依赖性激酶相关基因1、6表达显著下调，2、4、5表达极显著下调，21基因表达极显著下调。基于上述基因的表达情况，初步推测MRBE可能通过促进21上调，同时抑制细胞周期Cyclin-CDK复合蛋白与21基因的表达，进而诱导细胞周期阻滞在S期，最终抑制A375细胞的增殖。

图4 MRBE对A375细胞周期相关基因表达的影响

200、400 μg·mLMRBE处理A375细胞48 h后，细胞凋亡相关基因表达情况如图5所示，促凋亡蛋白相关基因、、-、表达极显著下调；抗凋亡蛋白相关基因-和表达均显著下调。上述结果表明，MRBE可能通过抑制-与等抗凋亡基因的表达促进A375细胞凋亡。

图5 MRBE对A375细胞凋亡相关基因表达的影响

3 结论与讨论

本研究利用修剪后的废弃杨梅枝条醇提物MRBE，从细胞增殖抑制率、细胞周期、细胞凋亡和相关基因表达等方面，开展其对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响与分子机制研究。随着浓度的增加，MRBE对A375细胞的抑制率逐渐升高，在400 μg·mL浓度下，抑制率达到最高49.46%，结合细胞形态观察，初步表明MRBE具有抗癌活性。已有研究者利用杨梅树皮醇提物，开展其对人肺腺癌A549细胞的影响，在100、200 mg·L浓度处理下，抑制率分别达到70.0%和87.0%，均显著高于相同浓度MRBE处理下的细胞增殖抑制率(3.31%和16.42%)，其原因可能与不同癌细胞的形态和生理差异、杨梅枝条和树皮有效特性成分不同等相关。本研究中MRBE对A375细胞周期的阻滞主要发生在G/M期。与前人针对人膀胱癌细胞YTS-1细胞周期的研究结果一致，利用杨梅树皮发现其对YTS-1细胞的阻滞作用也发生在S期。然而，当利用杨梅素和杨梅苷开展其对人前列腺细胞PC-3的阻滞作用时，发现主要在G/G期表现出显著的阻滞作用。上述研究表明，以杨梅为原材料的有效成分，对不同类型癌细胞的阻滞作用时期不同，推测其作用机制存在差异。本研究中，200、400 μg·mLMRBE处理的A375细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均显著高于对照组，表明MRBE对A375细胞有较强的抑制作用。基于上述MRBE对A375细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，明确了MRBE的抗癌活性作用，表明杨梅枝条存在一定的药用价值，后期可以充分利用修剪后的杨梅枝条，为研发相关抗癌候选药物提供原材料。然而，杨梅枝条的具体活性成分还不明确，需进一步通过试验进行鉴定。

细胞凋亡是受遗传机制控制的程序性细胞死亡，其过程受一系列基因表达、信号通路调控等作用。前人研究表明，细胞周期的失调是由致癌基因和肿瘤抑制基因之间的功能失衡引起，细胞周期Cyclin-CDK复合蛋白主要作用是磷酸化抑癌基因，同时释放被抑制的转录因子21，促进细胞周期由G期进展到S期。qRT-PCR结果表明，MRBE处理下，细胞周期蛋白基因和蛋白依赖性激酶基因均出现不同程度的下调表达，同时21显著下调(图4)。细胞周期重要调控因子21基因在癌细胞中控制细胞周期G、S、G期的致癌活性，随着21基因表达的上调，与Cyclin-CDK复合物结合起到抑制作用。此外，研究者利用香瓜醇提物处理乳腺癌细胞，发现其可通过上调21、27、1、1、基因的表达，下调下游、、2基因表达，从而抑制乳腺癌细胞生长；同时，研究者发现肺癌细胞在五氟利多作用下生长和转移受到抑制，21和27表达出现上调，Cyclin-CDK复合物蛋白基因表达显著下调。与前人研究结果基本一致，MRBE处理后，21基因表达显著上调，初步揭示了MRBE对A375细胞的抑制机理，即MRBE通过上调21表达，进而抑制-、21等基因表达，使A375细胞停滞在S期。

MRBE处理后，A375细胞促凋亡基因、、-、表达极显著下调，同时抗凋亡基因-、也出现显著下调表达。已有研究表明，可与凋亡抑制基因-2和-蛋白结合，最终使对应细胞发生凋亡。在本研究中，-2和-表达均出现下调，但与对照组相比差异不显著。进一步研究表明，Bcl-2家族通过与线粒体外膜直接相互作用控制细胞凋亡，其调节依赖于多种抗凋亡基因的表达，如-、-2、-等。-的上调促进肿瘤发生，而-的下调促进癌细胞凋亡，这与本研究结果基本一致，明确了MRBE处理下-基因的下调表达与癌细胞凋亡间的紧密联系。Ras/Raf/MEK/ERK通路在细胞周期调节、细胞增殖和分化、细胞凋亡等过程中发挥重要作用，大约在70%的人类黑色素瘤中发生突变，大量研究表明基因过度表达或激活是癌症的关键指标。在本研究中，MRBE处理后，基因显著下调表达，表明其与人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡密切关联。基于上述研究成果，可知MRBE对A375细胞周期和细胞凋亡相关基因的一系列调控作用，后期可以将挖掘到的显著差异表达基因，作为治疗人恶性黑色素瘤的关键靶点。

本研究充分利用果树修枝产生的废弃杨梅枝条，解析杨梅枝条醇提物MRBE对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的作用及其分子机制，推测MRBE可能通过调控p21/Cyclin-CDK/E2F1信号途径使A375细胞阻滞在S期，同时抑制抗凋亡蛋白基因-和的表达，促使A375细胞发生凋亡，最终实现对A375细胞的抑制作用。本研究为杨梅枝条药用价值的开发利用提供重要技术支撑，有助于实现杨梅资源的高值化全利用。