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桑黄中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分提取及其化学成分鉴定

2022-06-01郑美瑜张文娟陆胜民

浙江农业学报 2022年5期
关键词:抑制率黄酮提取物

郑美瑜,王 璐,2,刘 哲,张文娟,2,高 浦,3,陆胜民,*

(1.农业农村部果品采后处理重点实验室,浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室,浙江省农业科学院 食品科学研究所,浙江 杭州 310021; 2.浙江海洋大学 食品与药学学院,浙江 舟山 316022;3.南京农业大学 食品科学技术学院,江苏 南京 210095)

桑黄()是一种寄生于桑树、杨树等阔叶树腐朽的树干上的大型珍贵药用真菌,属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、针层孔属的真菌。桑黄的药用最早记载于《本草纲目》,传统具有化瘀、止血等作用。现代药理学研究表明,桑黄具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降血糖等功效,是国际公认的最佳抗癌真菌之一。据报道桑黄主要的活性成分有小分子的三萜酸和黄酮类物质,以及大分子的多糖类物质等,也对这些物质进行了提取研究。但对提取物的功能活性研究多集中于多糖类成分,对于黄酮类等小分子物质的研究还较少。

糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢疾病,在全世界发病率高,更是成为全球三大慢性非传染疾病之一,官方数据显示,到2025年,全球糖尿病发病人群将高达3.33亿人次。糖尿病的病因是由于受损的胰腺β细胞导致胰岛素分泌不足或者胰岛素抵抗等所致的糖代谢紊乱,目前常通过修复受损的β细胞、增加胰岛素敏感性、延缓糖类的消化吸收、增加周围组织对葡萄糖的利用等途径来干预,其中延缓糖类的消化吸收是一条重要的途径。α-葡萄糖苷酶是把碳水化合物水解成正常生理活动所需的葡萄糖的关键酶,抑制α-葡萄糖苷酶活性可以延迟碳水化合物的消化和吸收,从而减缓了血糖的快速升高,增强对胰岛素刺激作用的敏感性并减少对胰腺刺激作用,因此目前已经开发了多种α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物。但是合成的药物具有一定的毒副作用,且价格较昂贵,因此,已经开始逐渐从天然产物中筛选。本课题组在筛选桑黄中抑制α-葡萄糖苷酶的成分时发现,桑黄的水提取成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较低,而桑黄的醇提取物的抑制活性很强,表明桑黄中具有强烈抑制α-葡萄糖苷酶的物质存在。

因此,本文以α-葡萄糖苷酶抑制活性为引导,通过醇提法从桑黄中提取小分子物质,对提取工艺进行优化,并对提取物通过超高效液相和高分辨质谱联用仪鉴定了提取物中的主要多酚类、萜类等成分,以期为桑黄在α-葡萄糖苷酶抑制剂及其化学成分方面提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑黄子实体,采自浙江省农业科学院蚕桑研究所桑黄种植基地,子实体先晒至半干再在60 ℃烘干,干燥后磨粉并过40目筛备用。

α-葡萄糖苷酶(来自酿酒酵母)购自Sigma公司;pNP-α-Glu(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranosodide)和芦丁标准品购自上海源叶生物科技有限公司;乙醇、NaCO、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、二甲基亚矾(DMSO)均为分析纯。

酶标仪(BLx 800),美国BioTek仪器公司;其他仪器有水浴锅、旋转蒸发仪、冻干机、干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 黄酮标准曲线的绘制

精密称取30 mg芦丁用60%乙醇溶解,定容至100 mL容量瓶中,配制成300 mg·L芦丁溶液,取0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL刻度试管中,加60%乙醇至6 mL,加5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀,放置6 min,加4%氢氧化钠溶液2.5 mL,用水定容至25 mL,振荡摇匀后,室温下放置15 min。以第一管不加样品的试管调零,在512 nm波长处测定吸光值。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

在2 mL的离心管中加入pH 6.8的磷酸钾缓冲液560 μL,加入0.4 U·mL的 α-葡萄糖苷酶 100 μL,再加入不同浓度的样品溶液各40 μL,混匀,37 ℃恒温放置15 min,加入5 mmol·L的对硝基苯- α -D-吡喃半乳糖苷(PNPG)100 μL,混匀,37 ℃恒温反应 30 min。最后加入0.2 mol·L的NaCO溶液 400 μL,混匀,把反应液200 μL移入96孔的酶标板中,在405nm波长下测值。

1.2.3 α-淀粉酶抑制活性测定

试管内加入10 U·mL的α-淀粉酶50 μL,分别加入不同浓度的样品溶液20 μL,混匀,37 ℃恒温10 min,加入10 g·L淀粉溶液0.5 mL(或5 g·L淀粉溶液1 mL),混匀,37 ℃恒温反应3 min,加入1 mL DNS试剂,沸水浴中反应5 min,流水冷却,向试管中加入蒸馏水5 mL,混匀,于540 nm波长下测定各溶液的吸光度。

1.2.4 乙醇体积分数对桑黄黄酮和糖苷酶抑制率的影响

桑黄适量分别用体积分数0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇在80 ℃、料液比1∶20提取2 h,测定提取液中的黄酮含量。提取后的渣再提取一次,合并两次提取液,旋转蒸发浓缩,冻干,得到不同体积分数的乙醇提取物。提取物溶于20%的DMSO溶液中,配成浓度为10 g·L的溶液,用于糖苷酶抑制率的测定。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制成分提取工艺优化

根据前面乙醇浓度的试验结果,桑黄的醇提物对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制效果,而对α-淀粉酶的抑制较弱,因此对抑制α-葡萄糖苷酶的成分进行提取。结合文献报道,选择影响提取的四个因素乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间,每个因素三个水平,提取次数为1次,以黄酮提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标进行四因素三水平的正交试验优化,得到优化的工艺参数后,在优化条件下再进行提取次数的试验。

1.2.6 提取物中化学成分的鉴定

提取物中化学成分的鉴定通过Q ExactiveFocus 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪(Thermo Electron, Bremen, Germany)并连接戴安Ultimate 3000 UHPLC 系统(ThermoFisher Scientific, California, USA)。提取物适量用甲醇溶解,经0.22 μm的微孔滤膜过滤。

色谱条件:色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm), 流动相0.1%甲酸水溶液(B)和乙腈(A),进样室温度10 ℃,柱温35 ℃,洗脱梯度( 0~2 min,95%~80% A; 2~5 min,80%~ 70% A; 5~8 min,70%~65% A; 8~10 min,65%~35% A; 10~20 min,35%~2% A; 20~23 min,2%~2% A; 23~23.1 min,2%~95% A; 23.1~26 min,95% A),流速0. 3 mL·min,进样量1 μL。

质谱条件:电喷雾离子源,正,负离子模式下扫描,数据采用一级母离子全扫描和数据依赖性前三强二级子离子扫描(Full Scan MS/dd-MS2),质谱扫描范围: 120~1 500; 一级分辨率为 35 000, 二级分辨率为17 500;隔离窗口为2.0:喷雾电压(+)为3.5 kV, 喷雾电压(-)为3.0 kV; 鞘气压力为30 arb; 辅助气压力为10 arb; 毛细管温度为320 ℃; S-lens为50;归一化的碰撞能量为30 %、40%、60%。

2 结果与讨论

2.1 乙醇体积分数对桑黄提取液中黄酮含量和糖苷酶抑制率的影响

桑黄中的活性成分三萜酸、黄酮等具有不同的极性,不同的乙醇体积分数可以萃取不同极性的活性成分,因此,通过不同体积分数乙醇对活性成分进行筛选。不同体积分数乙醇提取桑黄中的黄酮提取率如图1所示,从图1可以看出,乙醇体积分数低和高都不利于黄酮的溶出,适中的乙醇体积分数黄酮的提取率较高,40%和60%的乙醇黄酮提取率较高。

图1 乙醇体积分数对桑黄黄酮提取率的影响

不同乙醇体积分数的桑黄提取物冻干后,溶于20%的DMSO中配成10 g·L浓度,对于抑制浓度超过100%的用缓冲溶液进行梯度稀释,测定稀释液的抑制率,不同体积分数的乙醇提取物在不同稀释倍数下对两种糖苷酶的抑制率如表1所示。从表1看出,乙醇体积分数较低时,提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率较低,而乙醇体积分数提高时,抑制率升高,其中60%乙醇提取物最高,80%的次之,IC分别为0.021 g·L和0.029 g·L。桑黄醇提物对α-淀粉酶的抑制率相比α-葡萄糖苷酶要低很多,10 g·L时的抑制率最高也只有69.2%,但乙醇体积分数对抑制率的变化规律与α-葡萄糖苷酶一致,也是乙醇体积分数为60%的提取物抑制率最高。因此,后续的提取研究中将提取对α-葡萄糖苷酶的抑制率较高的活性成分。

表1 桑黄不同乙醇提取物对两种α-糖苷酶的抑制率

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制成分提取工艺优化

根据乙醇体积分数试验的结果,结合文献报道,选择乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间,对桑黄中α-葡萄糖苷酶抑制成分的提取工艺进行正交试验,测定各提取液中的黄酮含量。提取液浓缩干燥所得提取物用20%DMSO配成10 g·L溶液并用pH 6.8的缓冲溶液稀释200倍,测定稀释液对α-葡萄糖苷酶的抑制率,试验结果如下表2所示,从表可知,影响总黄酮提取率的因素主次顺序为料液比>提取温度>乙醇体积分数>提取时间,最佳的提取工艺条件为乙醇体积分数40%,提取温度80 ℃,提取时间3 h,料液比1∶30;影响α-葡萄糖苷酶抑制率的因素主次顺序为料液比>提取时间>乙醇体积分数>提取温度,酶抑制率最高的最佳的提取工艺条件为乙醇浓度60%,提取温度70 ℃,提取时间3 h,料液比1∶30。综合桑黄黄酮和-葡萄糖苷酶抑制率的优化提取条件,桑黄中降血糖成分较优的提取条件定为乙醇体积分数60%,提取温度80 ℃,提取时间3 h,料液比1∶30,在该条件下黄酮的提取率为86.4 mg·g,比乙醇体积分数试验中提取率提高近一倍。根据已有的报道,该提取率要比回晶等、李善姬等的研究中黄酮提取率要高。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制成分提取正交试验结果

在该条件下对桑黄进行了提取次数实验,测定每次提取液中的黄酮含量,每次的提取液浓缩干燥的提取物用20%DMSO配成10 g·L溶液并用缓冲溶液梯度稀释,测定各稀释液对α-葡萄糖苷酶的抑制率,实验结果如表3所示,从表中可知提取2次黄酮已经基本溶出;对α-葡萄糖苷酶的抑制率第2次提取与第3次相差不大,因此,提取以2次为宜。

表3 提取次数对黄酮提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

2.3 抑制α-葡萄糖苷酶提取物的化学成分鉴定

提取物通过液质联用进行成分鉴定,通过参考文献、数据库和标准品对照,靶向分析了提取物中多酚、黄酮和萜类成分,共鉴定出45种成分,它们的高分辨率提取的总离子流图如图2所示,各成分的保留时间、准分子离子峰的质荷比、分子式、二级碎片等数据如表4所示,可以看出酚类物质种类最多,其次是黄酮类物质。酚类物质的母环有结构较复杂的吡喃酮和苯并吡喃酮结构,如Phelligridins、Phelligridimers、Interfungins、Phellifuropyranone系列化合物,该类化合物含有酚羟基较多,具有较强抗氧化和清除自由基的活性;也有较简单的单苯环酚酸类化合物,如原儿茶醛、丁香酸、原儿茶酸、咖啡酸等。

表4 α-葡萄糖苷酶抑制成分的鉴定结果

续表4 Continued Table 4

N-A、N-B为负离子模式;P-A、P-B为正离子模式。

3 结论

本文研究了桑黄对α-葡萄糖苷酶的抑制活性组分,结果表明,桑黄60%醇提物具有很强的抑制活性,其IC低至0.021 g·L。以α-葡萄糖苷酶的抑制活性和黄酮含量为引导,优化了乙醇体积分数、提取温度、提取时间和料液比四个因素,得到了较佳工艺参数,在优化条件下提取2次,黄酮提取率达到159.3 mg·g。通过UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS液质联用靶向分析了多酚、黄酮和萜类成分,共鉴定出45种成分。

通过本文的研究表明,桑黄中存在具有较强抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分,这些成分是小分子的多酚类物质。多糖类成分抑制活性较低,它们的降血糖活性可能是通过其它的途径。为了进一步更精确明晰抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分,后续还需要通过超滤质谱,明确真正与酶发生结合的组分,以及它们的结合强度。后续还需要通过体内实验验证这些具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分在体内的降血糖作用及其机制,以便后续开发桑黄降血糖的产品。

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