蓝桉根际菌根真菌的分离鉴定及其对蓝桉生长和光合特性的影响

王晓丽，赵英伟，孔晓娜，曹子林

(1.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224； 2.广西国有东门林场，广西 扶绥 532108； 3.西南林业大学 生态与环境学院，云南 昆明 650224)

蓝桉(Labill.)是桉树中少有的油材兼用树种，经济价值突出，现在我国云南省已有引种栽植和分布。依靠施用化学肥料来提高油、材产量是目前蓝桉人工林培育和经营中的常规管理技术；但是，施用化学肥料不仅成本高，而且还易对环境造成污染，不利于蓝桉人工林的可持续发展。研究发现，菌根不仅有助于培育壮苗，而且可增强苗木从环境中吸收水分和各种营养物质的能力，促进林木的生长发育，提高林木的产量和质量。桉树是典型的菌根营养型树种，给桉树接种适宜的菌根菌可以提高桉树的造林成活率、林木生产力和林木的营养成分含量。仲崇禄等的研究表明，不同地区、不同桉树树种接种不同菌根菌的效果不同，需要适树适菌、适地适菌。朱天辉等对四川的蓝桉进行研究，从不同郁闭度的林分中均分离出3种菌根菌，认为蓝桉是菌根型树种。谭方河等调查了四川蓝桉人工林菌根菌的种类，林下仅发现大孢硬皮马勃(Fr.)。然而，关于引种于云南的蓝桉菌根菌在本研究检索范围内尚未见报道。为此，本文从云南省昆明市呼马山蓝桉人工林中采集根际土壤：一方面，对根际土壤中的菌根真菌进行分离、鉴定与计数，调查其种类和优势种；另一方面，通过控制育苗基质中菌根真菌菌群的数量来分析菌根菌对蓝桉苗木生长和光合特性的影响，同时通过育苗前后基质中菌根真菌孢子种类和数量的变化与苗木生长指标、光合指标的逐步回归分析，探讨影响蓝桉苗木生长的主要菌根真菌种类。通过上述研究，旨在从菌根化育苗方面为蓝桉壮苗培育提供理论依据和实践指导，同时从造林材料方面入手解决蓝桉人工林经营中地力衰退和生产力大幅下降的问题。

1 材料与方法

1.1 蓝桉根际土采集

本研究采样的蓝桉林为26 a生蓝桉人工纯林，郁闭度0.7，位于云南省昆明市呼马山，当地年平均气温14.8 ℃，最高气温31.6 ℃，最低气温-7.8 ℃，年均降水量约1 000 mm，降水多集中在每年的5—9月。在蓝桉林内选取生长健壮的样株，在其树冠投影区内分东、南、西、北4个方位分别采集30 cm深处的根际土和须根，混匀后装入样袋带回实验室，备用。

1.2 菌根真菌分离、鉴定与孢子计数

采用湿筛法分离菌根真菌孢子。用甘油做浮载剂，制片。在尼康YS100生物显微镜(日本Nikon)(400×)下观察菌根真菌孢子，根据孢子的形态特征(大小、颜色、孢子壁的层次、厚度、孢子内含物等)对其进行鉴定。

取土样5 g，湿筛法分离，在Nikon SMZ1500型体视显微镜(日本Nikon)(10×)下计数，重复3次，并计算孢子密度。

1.3 蓝桉苗木培育试验设计

育苗地位于云南省昆明市西南林业大学苗圃。蓝桉种子来源于云南省林木种苗站。

开展单因素试验，共设计3个处理：处理1，灭菌根际土；处理2，1/2质量的不灭菌根际土，加1/2质量的灭菌根际土；处理3，不灭菌根际土。通过称量，控制所有处理基质的质量相同。每个处理设置3个重复，每个重复含30株苗木，共计270株苗木。田间布设采用随机排列。2018年5月15日播种育苗，2019年3月15日育苗结束。

1.4 指标测定

育苗结束时，每个处理随机取3株，挖出完整根系，冲洗掉根上的育苗基质，将根剪成1 cm长的小段，用蒸馏水清洗数次，放入FAA固定液中24 h。随后，先将根样置于10%(质量分数)KOH溶液中，90 ℃水浴1 h，蒸馏水清洗数次；然后，将根样置于10%(体积分数)HO中，室温静置20 min以漂白、软化根系，蒸馏水清洗数次；接着，将根样置于1%(体积分数)HCl溶液中酸化5 min，蒸馏水清洗数次；再接着，将根样置于0.05%(质量分数)苯胺蓝溶液中，90 ℃水浴35 min，染色。将染色后的根系放入乳酸甘油中浸泡，以去除多余的染色液，制片。在Nikon YS100型生物显微镜(日本Nikon)(400×)下观察被染色的根段数和相关特征，计算侵染率和侵染强度。

菌根侵染率(%)=侵染的根段长/根段总长×100。

依据受侵染的根段数占观察根段总数的比例，划分侵染强度(共5个等级)：Ⅰ级，0～5%；Ⅱ级，6%～25%；Ⅲ级，26%～50%；Ⅳ级，51%～75%；Ⅴ级，76%～100%。

分别于苗龄5个月时(2018年10月15日)和育苗结束时(2019年3月15日)测定各处理苗木的苗高、地径，且于育苗结束时测定各处理苗木根、茎、叶的干重。

育苗结束时，每个处理随机取3株苗木，在每株苗木的上、中、下部分别取叶片：(1)利用Li-6800型便携式光合作用测定系统(美国LI-COR)，于晴朗天气的上午9:00—11:30测定苗木的光响应曲线，分析苗木光合效率；(2)剪碎、混匀，备用。取0.1 g剪碎叶片，用95%(体积分数)乙醇溶液浸泡24 h，利用UV-6100扫描型双光束紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，通过分光光度法测定叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。

1.5 影响蓝桉苗木生长和光合特性的主要菌种筛选

对育苗基质中已鉴定出的不同真菌种类于育苗前后的孢子密度变化值和育苗结束时(10个月生)的蓝桉苗木的生长指标、光合特性指标做皮尔逊(Pearson)相关性分析。依据相关性分析结果，进一步开展逐步回归分析，建立回归方程。综合相关性分析和回归分析，筛选对蓝桉苗木生长起主导作用的菌种。

1.6 数据分析

所有数据利用Excel 2016软件整理，在SPSS 22.0软件中进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 蓝桉人工林菌根真菌的种类

从蓝桉根际土中共分离出3属6种菌根真菌，其中，球囊霉属()4种，分别为聚丛球囊霉()、何氏球囊霉()、多梗球囊霉()、摩西球囊霉()，近明球囊霉属()1种——幼套近明球囊霉()，隔球囊霉属()1种——缩隔球囊霉()。鉴定到的6种菌根真菌孢子的主要形态特征如图1～图6所示。

A，水中的孢子；B，孢子壁(L1、L2)。

A，水中的孢子、连菌孢丝(SH)；B，压破的孢子；C，孢子壁(L1、L2)。

A，水中的孢子；B，连菌孢丝(SH)；C，孢子壁(L1)。

A，水中的孢子、连菌孢丝(SH)；B，孢子壁(L1、L2、L3)。

A，水中的孢子、连孢菌丝(SH)；B，孢子壁(L1、L2)。

A，水中的孢子、连孢菌丝(SH)；B，孢子壁(L1)。

这6种菌根真菌在蓝桉须根中的侵染率均为99%，侵染强度均属Ⅴ级，总孢子密度为104 g，其中，摩西球囊霉、聚丛球囊霉、多梗球囊霉、幼套近明球囊霉、缩隔球囊霉、何氏球囊霉的孢子密度分别为18、38、10、28、8、2 g，聚丛球囊霉的孢子密度占总孢子密度的比例达36.5%，为优势菌种。

2.2 不同处理下蓝桉苗木的菌根侵染情况

处理1～处理3下，育苗基质中的菌群数量增多，至育苗结束时，处理1～处理3下蓝桉苗木的菌根侵染率亦相应呈增大趋势，且侵染强度同步增强(表1)。菌根侵染后，蓝桉苗木根部形态、菌丝和泡囊如图7所示。

a，菌根外观形态；b，根内菌丝(100×)；c，根内泡囊(100×)。

表1 不同处理下蓝桉苗木的菌根侵染率和侵染强度

2.3 不同处理下基质中菌群数量的变化

对比育苗前后不同处理基质中菌群数量的变化(表2)：处理1的基质中在育苗前后都未观察到菌根真菌孢子；处理2和处理3的基质中，鉴定到的6种菌根真菌的孢子密度在育苗后均较育苗前有所增加，其中，孢子密度变化量最大的为聚丛球囊霉，其次是幼套近明球囊霉和摩西球囊霉，何氏球囊霉的变化最小。

表2 育苗前后不同处理基质中菌根菌的孢子密度

2.4 不同处理下蓝桉苗木的生长情况

苗龄5个月时，蓝桉的苗高以处理2最高，处理3最低，两者差异显著(<0.05)，但3个处理蓝桉的地径无显著差异(表3)。苗龄10个月时，蓝桉的苗高、地径以处理2最高，处理3最低，两者差异显著(<0.05)，且处理2的苗高还显著(<0.05)高于处理1，3个处理在根干重、茎干重、叶干重上无显著差异。综合2个苗龄蓝桉的生长情况和生物量，处理2对蓝桉苗木生长具有更好的促进作用，说明向育苗基质中接种一定数量的菌根真菌有利于促进蓝桉苗木的生长，提高其生物量，但基质中菌根真菌的接种数量也不是越多越好。

表3 不同处理对蓝桉苗木生长情况和生物量的影响

不同处理下，蓝桉苗木的叶绿素a、总叶绿素含量和表观量子效率随育苗基质中菌群数量的增多而增大，且处理3显著(<0.05)大于其余2个处理(表4)；光补偿点和光饱和点皆随育苗基质中菌群数量的增多而减小，且处理3和处理2皆显著(<0.05)小于处理1。由此可见，接种一定数量的菌根真菌(处理2和处理3)有助于提高蓝桉苗木的叶绿素含量，降低光补偿点，提高其表观量子效率，从而有利于苗木的生长和生物量的积累。

表4 不同处理对蓝桉苗木叶绿素含量、叶面积指数和光合参数的影响

2.5 影响蓝桉苗木生长和光合特性的主要菌种筛选

相关性分析结果(表5)显示，仅聚丛球囊霉与苗高呈显著(=0.017<0.05)正相关。仅从相关性上看，有5种菌根真菌与苗高高度相关(>0.9)；6种菌根真菌均与根干重高度相关；茎干重、叶干重和最大净光合速率分别与1～2种菌根真菌高度相关；而地径、表观量子效率、暗呼吸速率、光补偿点和光饱和点与这6种菌根真菌均无高度相关性。

表5 已鉴定菌种与蓝桉苗木生理生化指标的相关性

取苗高、根干重和最大净光合速率分别与已鉴定的6种菌根真菌做逐步回归分析，结果(表6)表明：苗高与聚丛球囊霉()和缩隔球囊霉()具有显著(<0.05)线性正相关关系，根干重与聚丛球囊霉和幼套近明球囊霉()具有显著(<0.05)线性正相关关系，最大净光合速率与聚丛球囊霉和幼套近明球囊霉具有显著(<0.05)线性正相关关系，且其回归模型的拟合度均较高(≥0.995)。综上判断，对蓝桉苗木生长和光合作用起主要促进作用的是聚丛球囊霉、幼套近明球囊霉和缩隔球囊霉，其中，对苗高起主导促进作用的菌种为聚丛球囊霉，对根干重起主导促进作用的菌种为幼套近明球囊霉，对最大净光合速率起主导促进作用的菌种为聚丛球囊霉和幼套近明球囊霉。

表6 已鉴定菌种与蓝桉苗木生长指标以及光合特性的逐步回归分析

3 讨论

鉴于蓝桉的生态学特性，我国仅在云南和四川有引种栽培。本研究从云南昆明的蓝桉人工林根际土中分离出3属6种菌根真菌，分别是幼套近明球囊霉、缩隔球囊霉、摩西球囊霉、多梗球囊霉、聚丛球囊霉和何氏球囊霉。朱天辉等从四川不同郁闭度的蓝桉林分中均分离出幼套近明球囊霉、摩西球囊霉和缩隔球囊霉，在郁闭度0.7以上的林分中分离出聚丛球囊霉。多梗球囊霉和何氏球囊霉在以往的关于桉树菌根菌的分离研究中未见报道，但在云南的西南桦等植物根际土，以及干热河谷生境土壤的菌根菌调查中有相关报道。由此推测，这2种菌根菌的分布可能与云南的地理环境，尤其是土壤环境关系密切。结合云南和四川两地蓝桉人工林根际土中菌根菌的调查结果，认为幼套近明球囊霉、摩西球囊霉和缩隔球囊霉为蓝桉固有的菌根真菌；聚丛球囊霉仅出现在郁闭度较大的蓝桉林分中，且为优势菌群；多梗球囊霉和何氏球囊霉为蓝桉在云南栽培区的特有菌根真菌。

苗龄10个月时，随着育苗基质中菌群数量的增多，蓝桉苗木的菌根侵染率增大，侵染强度增强；同时基质中6种菌根真菌孢子数量的增加幅度皆以育苗前基质中的孢子数量为基础，初始数量多的，后期增量大。综合5个月和10个月2个苗龄蓝桉苗木的生长(苗高和地径)情况来看，处理2对蓝桉苗木生长具有更好的促进作用，说明育苗基质中，接种一定数量的菌根真菌有利于促进蓝桉苗木的生长。本研究结果与仲崇禄等对尾叶桉和巨尾桉苗木接种菌根真菌，以及刘建福等对澳洲坚果幼苗接种菌根真菌的效果一致。与处理1相比，处理3可显著提高蓝桉的叶绿素a和总叶绿素含量、表观量子效率，显著降低光补偿点和光饱和点，说明向育苗基质中接种一定数量的菌根真菌有利于蓝桉苗木光合产物的合成与积累。这与朱凌骏等和常双双等报道的菌根真菌对榉树和君迁子光合特性的影响一致。本研究发现，对蓝桉苗木生长和光合作用起主要促进作用的是聚丛球囊霉、幼套近明球囊霉和缩隔球囊霉。主导菌种的筛选研究，可为蓝桉苗木培育提供接菌种类的指导。

针对本文分离鉴定出的6种菌根真菌，作者团队已利用三叶草开展单孢扩繁，但由于时间原因，目前还未获得足够数量的纯化菌种。这在一定程度上限制了我们就这些菌根真菌对蓝桉苗木生长影响机制的进一步深入研究。后期，可在本文研究基础上，在育苗时接种对蓝桉苗木生长起主导促进作用的纯化菌种，深入探讨菌根真菌对蓝桉苗木生长的促进机制，从而为蓝桉的壮苗培育提供理论基础和实践指导，为蓝桉人工林的可持续发展提供优质苗木材料。