六个丝瓜品种对南方根结线虫的抗性

陆景伟，陈国康，周 娜，魏 捷，胡 燕，郑 阳，陶伟林，*

(1.重庆市农业科学院 蔬菜花卉研究所，重庆401329； 2.西南大学 植物保护学院，重庆400716)

瓜类蔬菜在我国蔬菜中占有重要地位，占全国30种主要蔬菜的10.16%，其中，黄瓜5.28%、冬瓜1.4%、苦瓜0.53%、丝瓜0.57%。大部分瓜类蔬菜根系较弱，抗病性差，易得根结线虫病，导致瓜类蔬菜减产30%左右。由于根结线虫病原不断累积，病害越来越严重，化学药剂使用量越来越高，导致土壤中积累了一些高毒、破坏臭氧层的残留线虫剂，污染了土壤，破坏了生态环境，影响了蔬菜的安全生产，限制了瓜类蔬菜的产量提升和品质改良。抗根结线虫丝瓜材料的创新和品种(砧木)选育是解决上述问题的重要途径之一。

瓜类蔬菜营养丰富，其产量高、供应期长、经济效益显著，是城郊菜农的首选蔬菜作物之一。近年随着重庆城郊丝瓜种植规模扩大，根结线虫病成为制约丝瓜安全生产的重要因素。根结线虫病由spp.引起，是我国瓜类蔬菜生产的主要病害，其中，南方根结线虫()在我国温带地区发生危害最为普遍，而在亚热带地区爪哇根结线虫()是优势种群。根结线虫的生活史分为卵、幼虫、成虫3个阶段，幼虫又分为4个龄期，其中，2龄幼虫(J)是存活于作物根际的侵染期虫态，侵入根系后发育蜕皮成3龄、4龄，最后再由4龄蜕皮变为成虫，雌成虫体外产卵，在尾部形成一个黏性的囊状结构——卵囊。根结线虫病害的防治，除了轮作、物理和化学药剂、生物防治等方法外，选用抗病品种是控制该病的重要途径之一。

对根结线虫病的抗性鉴定方法有实验室鉴定、温室鉴定、田间鉴定3类，但各有适用条件和优缺点。实验室鉴定行业标准NY/T1857.8—2010以黄瓜为例，详述了对人工接种、培育发病、调查分析的全过程。温室鉴定与实验室鉴定基本类似，不同点在于接种和培育的环境始终在温室内进行，抗性评价方法多样。董炜博等采用发病率、病情指数和病程曲线下面积(AUDPC)来综合评价抗性水平；雒振宁等采用相对抗病性评价方法，通过线性回归与相关性分析，提出直接观测根部虫瘿数来快速评价花生的抗性水平。田间鉴定方法是在作物实际生长环境下进行的抗性鉴定，该方法实施简单，自然诱发、无需接种。秦东等在番茄砧木品种抗病性的田间鉴定中，用发病率与病情指数来评价抗性；侯生英等参照Soriano方法，用繁殖系数(即收获期和播种前的孢囊量比值)来评价小麦对孢囊线虫病的抗性；赵洪海等用初始群体密度与最终群体密度比值是否大于1来区分感病或抗病，再结合相对抗病指数综合评价品种抗性水平。

本研究通过调查田间病情指数、根系结瘤数量、根际2龄幼虫(J)数量、实验室根系染色计数线虫等，并做重复试验验证，综合评价6个供试丝瓜品种对南方根结线虫的抗性水平，初步建立丝瓜抗根结线虫评价方法，为瓜类蔬菜根结线虫多指标抗性评价提供科学参考和借鉴。同时，筛选了丝瓜抗根结线虫材料，为丝瓜新品种选育与瓜类蔬菜抗根结线虫砧木品种培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 丝瓜根结线虫的形态学鉴定

采集重庆市九龙坡区丝瓜基地根结线虫病根样品，随机挑选30个根样，徒手解剖分离根结线虫成熟雌虫30头。参考冯志新的技术方法和标准，在光学显微镜下测量其口针长度、口针基部球至肠前端的距离(DEGO值)，镜检观察雌成虫的会阴花纹特征。

1.2 田间丝瓜根结线虫病情调查

收获后期，挖取6个丝瓜品种所有植株根样，参照NY/T1857.8—2010方法，计算发病率和根结指数，以及抗性分级。

(%)=×100；

(1)

=∑(×)/。

(2)

式(1)和(2)中：为发病率，为调查总株数，为各病情级别病株数，为根结指数，为各病情级别代表数值。

根结指数值在0～5，作物品种抗性分级标准：0<≤1.0为高抗HR，1.0<≤2.0为抗病R，2.0<≤3.0为中抗MR，3.0<≤4.0为感病S，4.0<≤5.0为高感HS。依据目前国际通行的0～5级标准计算病情指数()，抗性等级划分标准：0为免疫，0<≤20.0为高抗(HR)，20.0<≤40.0为抗病(R)，40.0<≤60.0为感病(S)，60.0<≤80.0为中感(MS)，80.0<≤100.0为高感(HS)。

1.3 丝瓜根际2龄幼虫的分离计数

分别于丝瓜定植期、抽蔓期、结果期和种瓜成熟期采集根际土样，土壤样品采自丝瓜生育期根际0～5 cm、深度0～20 cm土层。每个品种随机编号，定3株并从其根际取样，每株1个土样，共取样3份，每份约200 mL。将其充分混匀后，再从中量取100 mL土样，采用漏斗法分离丝瓜根际土壤2龄幼虫并计数。根结线虫J的主要鉴别特征是：热杀死后，虫体伸直，尾部细棒形，短小，尾尖有明显亮区，头部口针因处于发育中不易观察，但颈部中食道球较为明显。

依据丝瓜定植期、抽蔓期、结果期和种瓜成熟期分离检出的J数量，计算根结线虫的繁殖系数。

=/。

高职院校科研成果推广主要有3种方式：课题组成员自身推广、学校科研成果推广机构、市场中介机构。西方一些国家设有专门的科研成果服务部门，高校内部还有相应的对接机构，专门负责科研成果助推工作。科研成果推广的过程中会涉及许多的部门和单位，目前我国缺乏这种科研成果转化服务体系，各种国家支持政策也不到位。

(3)

式(3)中：为丝瓜各生育期土壤中的J数量，为在丝瓜幼苗移栽时土壤中的J数量。

2019年4月上旬丝瓜定植期，田间随机采集6个材料所在小区的土壤样品，分离检测J数量并计算其平均数，作为试验田土壤根结线虫的起始密度。

1.4 丝瓜根系染色与线虫计数

于丝瓜结果期(6月初)即病害侵染高峰期，每个丝瓜材料随机选取3株，每株切取5条长5 mm的根段，位于幼嫩根系成熟区，根段色泽浅白微黄。采用次氯酸钠-酸性品红染色法，镜检记录15条根段中的根结线虫总数量，包括幼虫、成虫和卵3种虫态，比较其侵染根系后的发育程度。

1.5 人工接种验证试验

2020年10月进一步开展温室盆栽人工接种验证试验。丝瓜材料种子经50 ℃水催芽2～3 d后，将其定植于温室盆钵中，每盆种1株，共30盆。在其周围接种配制好的根结线虫卵悬浮液10 mL，接种浓度为2 000 mL。25 ℃，光照条件16 h光照、 8h黑暗，每2 d浇Hoagland营养液1次，保持土壤湿润，75 d后调查6个材料各自的发病率和病情指数。

2 结果与分析

2.1 丝瓜根结线虫的形态学鉴定

从重庆九龙坡丝瓜基地采集的根结线虫雌成虫，其口针长度15.1 μm、DEGO值2.7 μm，会阴花纹具高的方形背弓特征(图1)，这3项指标基本符合南方根结线虫特征，因此，形态学鉴定其为南方根结线虫。

图1 重庆九龙坡丝瓜根结线虫雌成虫会阴花纹(400×)

2.2 田间根结线虫病情指数

2019年8月丝瓜种瓜成熟期，田间病情调查结果如下(表1)，1号和5号根结指数最大，其次是33号和32号，再次为6号和2号。依据病情指数指标划分抗性等级：1号材料(=65.3)为中感MS；5号材料(=55.3)为感病S，32号、33号为抗病R，2号和6号为高抗HR。以上结果与依据根结指数划分的抗性等级基本一致，仅1号、5号材料抗性等级略有上升。

表1 丝瓜种瓜成熟期根结线虫病情调查(2019年)

在丝瓜抽蔓期即根结线虫侵染早期，通过刨根调查根系结瘤数也提前预知了病害发展的结果，1、2、5、6、32、33号材料侧根每10 cm幼嫩根段上平均检出早期根结数分别为12.2、2.1、14.8、0、0、0个，材料1号和5号根结数最多，而其余材料极少见，即早期1号和5号材料感染线虫最重。

2020年4—8月在该试验地重复开展田间试验，种瓜成熟期调查结果显示，6个材料的发病状况与2019年的趋势一致，除33号外各材料的发病率和病情指数均略有升高，具体的发病率和病情指数为：1号100.0%、72.5，2号54.3%、17.6，5号100.0%、63.7，6号57.8%、20.4，32号86.1%、33.4，33号91.5%、30.7。

2.3 丝瓜根际的线虫繁殖系数

2019年4月上旬丝瓜定植，每100 mL试验田土壤中根结线虫J幼虫的平均数量为98.2条，为试验田块初期土壤线虫数量。依据公式计算得到抽蔓期、结果期、种瓜成熟期丝瓜根际的线虫繁殖系数值(表2)。当繁殖系数大于1时，所在丝瓜生育期J的种群数量比初期有增长，反之则下降。丝瓜3个生育期的繁殖系数均值显示，1号、5号材料根际土壤中J的种群密度有所提高，2号、6号、32号、33号材料根际土壤中J的种群密度有所降低。

表2 根结线虫在丝瓜主要生育期的繁殖系数

2.4 丝瓜根系染色与线虫计数

在丝瓜结果期，对根中根结线虫进行染色并计数，结果(图2、表3)显示：在1号材料每5 mm幼嫩根段中平均检测出34条(粒)虫体或卵，其次是5号，2号、6号材料检出线虫数最少。1号材料根段中成虫和卵数量均为最多，6号仅检出成虫和幼虫，没观测到卵，2号、32号未检测到幼虫。以上结果显示，6个材料中1号、5号根段中线虫数量最多，各虫态占比较均衡。

表3 丝瓜结果期幼嫩根中(5 mm根段)根结线虫的检出数量

图2 丝瓜结果期幼嫩根段中的线虫卵粒和雄成虫(比例尺=20 μm)

2.5 温室盆栽根结线虫病情指数比较

2020年10—12月温室盆栽验证试验结果(表4)显示，1号、5号材料为感病，2号和6号为高抗，32号、33号为抗病。该温室盆栽试验与2019年田间试验结果和抗性差异趋势基本一致，但总体病情略轻，仅有5号材料抗性等级由原来的中抗评定为感病。

表4 2020年丝瓜温室盆栽试验根结线虫病情调查

3 讨论

重庆地区苦瓜、丝瓜等瓜类蔬菜种植基地的根结线虫种群经形态学鉴定为南方根结线虫，与前人报道的南方根结线虫地理分布结果一致。该物种的寄主范围甚广，除丝瓜外还可为害番茄、黄瓜、甘蓝、莴苣、山药、柑橘、烟草等经济作物，需要在今后的农业生产中给予密切关注。

借鉴前人的抗根结线虫评价方法，通过调查田间病情指数、根系结瘤数量，结合根际J幼虫计数、根段线虫检测，判定2号和6号为高抗(HR)，二者的田间病情指数最低、10 cm根段结瘤数量最小、根际线虫繁殖系数最低、根组织线虫数量最少或较少，且各虫态分布不均衡。按照多项指标依序判定，32号和33号为抗，1号、5号为感病。按根结指数划分，5号材料为中抗(MR)，在两个评价指标体系中表现为摇摆。2020年温室试验依据病情指数，5号材料再次被判定为感病；因此，认为病情指数评价体系可能更适合丝瓜的抗性鉴定。2020年在同一地块重复开展田间试验，以及温室条件下通过人工接种验证试验，获得了与2019年田间试验抗性评价基本一致的结果，提升了研究结果的可信度，为通过转录组、代谢组深入分析丝瓜的抗性机制，进一步发掘和利用抗根结线虫基因提供了重要基础。丝瓜资源遗传多样性较为丰富，利用抗性材料，进行有选择的杂交组合配制，能够快速、准确地选育符合目标性状的优良丝瓜新品种。

4项指标层次不同，但相互呼应，总体展现了较为一致的结果，特别是丝瓜各生育期线虫的繁殖系数与种瓜成熟期根结指数之间，显示了明显的正相关关系(=0.99)；因此，线虫的繁殖系数值可作为抗性分级的重要辅助指标。此外，之所以选择在丝瓜抽蔓时(6月初)刨根调查根系结瘤数，一是此期为根结线虫侵染早期，具有病害预警的作用；二是此期丝瓜幼嫩根段上根结尚处于膨大隆起初期，还没有发生结瘤之间的重叠并合，便于准确计数。

丝瓜1号材料根段中线虫数量最多，卵、幼虫、成虫3种虫态全部检出，表明线虫侵入根后能有效利用根系进行营养生长繁殖，完成生活史，实现持续寄生的目的。6号材料虽检出成虫和幼虫，但没检测到卵粒，表明该材料可能抑制线虫的发育，特别是成虫性成熟的进程，造成其生活史产卵阶段被延缓或停止。上述结果也为材料的抗感性判定提供了合理的解释依据。

采用根结指数评定材料或品种的抗性水平已被业内研究者广泛认同，但需要强调的是，试验所选感病对照组的根结指数须大于3，即整个试验的发病压力达到一定水平条件下，才能认定所开展的抗性鉴定结果有效，否则可能出现严重的误判。本研究丝瓜1号材料的根结指数大于3，符合鉴定要求，相关抗性结果判定具有科学依据，后期通过室内盆栽人工接种试验，在更加稳定可控条件下进一步评价其抗性，从而为瓜类蔬菜生产上合理筛选抗性材料提供借鉴和参考。

4 结论

4项指标数据综合评价，判定2号、6号材料为高抗，32号、33号材料为抗，1号、5号材料为感病。田间试验与温室接种试验相互验证，说明田间鉴定丝瓜抗根结线虫的4项指标可行可靠，可以作为抗南方根结线虫的评价指标，根据其中2个指标能够直接判断丝瓜对根结线虫的抗性，为瓜类蔬菜根结线虫多指标抗性评价提供科学参考和借鉴。