七氟醚上调PI3K/Akt/mTOR活性对小鼠心肌缺血再灌注损伤中自噬水平的影响

任倪辉，郭志佳，王 鑫，王成钢，张文颉，田首元

心肌缺血再灌注损伤是指心肌经过缺血应激后，恢复血供反而出现比缺血更严重损伤的病理生理过程，是心脏直视停跳体外循环手术的最大并发症，也一直是临床麻醉心肌保护方面亟待解决的难题。缺血再灌注损伤机制有多种途径，其中过度激活自噬，触发程序性细胞死亡是损伤近年来关注的重要机制。吸入麻醉药七氟醚通过麻醉药预处理(anesthetic preconditioning, APC)作用，可以显著防治心肌缺血再灌注损伤，其机制主要通过磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路介导。七氟醚是否参与抑制心肌自噬作用成为国内外最新研究热点。本研究从雷帕霉素(mTOR)角度提出PI3K/Akt作用的下游蛋白经mTOR介导调节自噬的假说，并使用PI3K抑制剂来观察mTOR的活性变化及自噬水平变化，探讨七氟醚对小鼠心肌缺血再灌注损伤保护是否通过调节自噬水平产生作用，为其作为防治心肌缺血再灌注损伤的一线用药提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 6～8周龄成年雄性C57BL/6J小鼠24只，由北京西扬养殖中心提供，体重(25±3)g，随机分4组(=6)：假手术组，只开胸不结扎；缺血再灌注组(1%戊巴比妥钠麻醉手术)；七氟醚组和七氟醚+LY294002组，2%七氟醚麻醉手术；七氟醚+LY294002组，术前一周每日腹腔注射1次1 ml的设计剂量的LY294002(PI3K阻断剂，9901，CST，美国)，将0.3 mg/kg的LY294002溶于生理盐水中；其余3组注射1 ml生理盐水。所有实验方案符合山西医科大学动物实验伦理要求。

1.2 模型制备 用2%七氟醚吸入(或1%戊巴比妥钠)麻醉动物后气管插管机械通气。沿剑突至左腋窝将皮肤剪开，钝性分离胸大肌、胸小肌，用血管钳从第4～5肋间心尖搏动最强处插入胸腔，撑开肋间隙将心脏挤出，在显微镜下用7-0丝线，于肺动脉根部下方2 mm用活结结扎左前降支(LAD)45 min，将心脏送回胸腔，左室远端苍白且心电图Ⅱ导ST段抬高示缺血成功，活结线头留在胸腔外，荷包缝合皮肤，45 min后再次麻醉后松活结，心肌恢复血供、ST段回落>1/2提升再灌注成功。关胸待动物苏醒，自由活动24 h后，采集血液和心肌标本进行分析。

1.3 心肌损伤标志物 实验结束后，颈总动脉取新鲜血液4 ml，新鲜血液1500 g离心15 min，分离出血浆，置-20 ℃冰箱保存批量待测。使用全自动生化仪(7600，Hitchi，日本)自动检测肌酸激酶-MB(CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)水平。

1.4 自噬标记物及信号通路蛋白 Western blot检测方法，心肌组织冰上称重，液氮下研磨，加入RIPA与PMSF混合裂解液，冰上静置提取总蛋白，离心收集上清液，BCA法行定量分析、标记分装。LSD、DTT处理样本、95 ℃变性处理，-80 ℃保存待测。现配10%硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，按顺序上样，80 mV垂直电泳至marker完全分离。三明治法将凝胶蛋白质在100 V电压下转移至硝基纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭1 h。以下抗体均来自美国CST公司(稀释比例1∶1000)，包括微管相关蛋白Ⅰ轻链3 LC3(2775)，自噬相关蛋白1 Beclin1(3738)，PI3K(4257)，p-PI3K(Tyr458/Tyr199，4228)，Akt(4691)，p-Akt(ser473，4060)，mTOR(2972S)，p-mTOR(ser2448，2971S)；内参蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH(BM3896，1∶5000，武汉)；二抗(BA1054，1∶5000，武汉)。TBST洗膜5 min×3次，一抗4 ℃滚动孵育过夜，TBST洗膜后再次5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜5 min×3次，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次。配置AB显影液(Thermo，美国)，均匀浸泡硝基纤维素膜，避光孵育1 min。化学发光成像分析系统(ChemiDoc XRS+，bio-rad，美国)曝光拍照，Image-lab软件量化分析条带灰度。

2 结 果

2.1 心肌损伤标志物 与假手术组相比，缺血再灌注组、七氟醚组和七氟醚+LY294002组的血浆CK-MB和cTnI水平增高(<0.05)；与缺血再灌注组相比，七氟醚组和七氟醚+LY294002组血浆CK-MB和cTnI水平降低(<0.05)；与七氟醚组相比，七氟醚+LY294002组血浆CK-MB和cTnI水平降低(<0.05，表1)。

2.2 心肌自噬标志物 与假手术组相比，缺血再灌注组、七氟醚组和七氟醚+LY294002组的心肌自噬标志蛋白LC3和Beclin1水平均增高(<0.05)；与缺血再灌注组相比，七氟醚组和七氟醚+LY294002组的LC3和Beclin1水平均降低(<0.05)；与七氟醚组相比，七氟醚+LY294002组的LC3和Beclin1水平均增高(<0.05，表1)。

2.3 信号通路蛋白 与假手术组相比，七氟醚组的PI3K、Akt、mTOR总蛋白水平差异无统计学意义，而缺血再灌注组PI3K、Akt水平增高(<0.05)，且mTOR蛋白水平降低(<0.05)，七氟醚+LY294002组PI3K水平增高(<0.05)，且Akt、mTOR蛋白水平降低(<0.05)。磷酸化PI3K、Akt、mTOR与总蛋白比值结果：与假手术组相比，缺血再灌注组、七氟醚组和七氟醚+LY294002组的磷酸化PI3K、Akt、mTOR与总蛋白比值降低(<0.05)。与缺血再灌注组相比，七氟醚组的磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白与总蛋白比值升高(<0.05)。与七氟醚组相比，七氟醚+LY294002组的磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白与总蛋白比值均降低(<0.05，表1)。

表1 不同处理下小鼠血浆心肌指标的比较

3 讨 论

自噬是心肌缺血再灌注损伤致心肌细胞死亡的主要途径之一，也是受损的细胞器及蛋白质经溶酶体降解，产物循环利用产生能量维持细胞活动的一种细胞生物学行为。因此，自噬是一把双刃剑，可以维系细胞新陈代谢的物质平衡，系统过度激活也会造成细胞不可逆损伤过程。缺血再灌注引发心肌细胞过度自噬，加重了伴随梗死的细胞不可逆损伤。LC3和Beclin1作为自噬的标志蛋白，可以客观衡量自噬发生的水平。缺血再灌注七氟醚的药物预处理ICP作用经典信号通路是PI3K/Akt。药物预处理ICP作用通过经典PI3K/Akt通路，调控下游细胞生长、增殖、存活、凋亡等多种细胞行为，调节缺血再灌注心肌细胞糖原合成和葡萄糖转化功能需求，从而实现心肌保护作用。大量研究表明，PI3K/Akt通路是细胞生长和存活的主要调节蛋白，也是心肌细胞缺血再灌注损伤的主要途径之一，通过Akt蛋白调节下游多个信号通路实现其生物效应。

麻醉药物七氟醚通过PI3K/Akt通路介导对心肌缺血再灌注损伤保护，而对自噬的影响研究尚不充分。本实验通过检测自噬标志蛋白LC3和beclin1证明，七氟醚显著抑制了缺血再灌注引发的心肌过度自噬；使用特定的 PI3K 抑制剂LY294002，发现可以部分消除这种保护作用。有证据表明，Akt可以直接磷酸化mTOR蛋白，从而启动由mTOR介导的代谢相关效应。mTOR是哺乳动物诱导自噬的关键调节分子。mTOR是ATP感受器，其活性参与自噬体形成及成熟过程。能量缺乏时，细胞磷酸化mTOR活性水平增加，mTOR复合体形成障碍，可以负反馈调节自噬，减少细胞缺血再灌注损伤，增强心功能。因此，mTOR蛋白可以作为枢纽蛋白，桥接七氟醚的ICP作用和缺血再灌注的自噬过程。

本研究结果表明，在缺血再灌注条件下，心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路的蛋白磷酸化水平受到显著抑制，而七氟醚显著提高了该通路磷酸化活性，且与缺血再灌注心肌损伤即自噬水平变化一致，说明七氟醚确实可以激活PI3K/Akt通路，且大幅逆转由缺血再灌注引发的通路活性抑制，从而实现对缺血再灌注心肌的保护作用。其中对自噬水平的调节作为缺血再灌注心肌保护作用的一个重要组成部分。此外，进一步使用PI3K抑制剂结果提示，抑制PI3K可以一定程度上降低p-mTOR的磷酸化水平，证明了PI3K/Akt通路的确与mTOR蛋白之间存在上下游的作用关系。抑制该信号通路，可以显著增加缺血再灌注心肌损伤程度及自噬水平，即一定程度上消除了七氟醚对缺血再灌注心肌的保护作用。

综上，七氟醚可能通过上调PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化活性水平，抑制了缺血再灌注诱导的过度自噬，从而为七氟醚心肌保护机制提供更多研究证据。深入对PI3K/Akt/mTOR通路进行蛋白质及代谢组学的研究将是本课题组未来研究方向。