黄芪多糖对大鼠脑卒中后抑郁的影响

刘丽珠 刘薇 樊琳

[摘要] 目的 探讨黄芪多糖（APS）影响大鼠脑卒中后抑郁（PSD）的可能机制。 方法 先采用旷场实验筛选出合格的Wistar大鼠48只，采用随机数字表法将其分为空白对照组、模型对照组、APS低剂量组和APS高剂量组，每组12只。除空白对照组外，其他三组均采用线栓法构建大鼠局灶性脑缺血模型，并于术后经慢性不可预见性应激法（CUMS）结合孤养的方法建立大鼠PSD模型。术后APS低剂量组和APS高剂量组按200 mg/（kg·d）和400 mg/（kg·d）灌胃给予APS溶液治疗4周，模型对照组和空白对照组灌胃给予等体积生理盐水。治疗结束后检测海马CA1区组织中核转录因子-κB（NF-κB）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）蛋白及其基因表达并结合行为学实验和电生理实验分析APS对大鼠PSD的影响。 结果 与模型对照组比较，膜片钳记录显示，APS低剂量组和APS高剂量组CA1区自发性动作电位（AP）和群峰电位（PS）电压均明显降低，NF-κB蛋白和mRNA低表达，而PPAR-γ蛋白及mRNA明显高表达，差异有统计学意义（P < 0.05）;糖水摄取实验显示APS低剂量组和APS高剂量组糖水摄取量较模型对照组明显增多，水迷宫实验显示两组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，且穿台次数明显增多，差异有统计学意义（P < 0.05）。APS高剂量组上述各指标变化较APS低剂量组更明显，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 APS可能通过抑制NF-κB信号通路的磷酸化反应，稳定脑海马CA1区AP和PS电压而发挥对PSD的治疗作用。

[关键词] 大鼠;黄芪多糖;脑卒中后抑郁;电位;NF-κB信号通路;磷酸化

[中图分类号] R743          [文献标识码] A          [文章編号] 1673-7210（2019）03（a）-0011-04

[Abstract] Objective To investigate the effects and possible mechanism of astragalus polysaccharide （APS） on post-stroke depression （PSD） in rats. Methods Wistar rats were screened by open field test， and a total of 48 eligible rats were divided into blank control group， model control group， APS low dose group and APS high dose group according to random number table method， with 12 rats in each group. The model of focal cerebral ischemia was established using suture-occluded method in all groups except the blank control group， and the rat PSD model was established by isolation housing combined with chronic unpredictable stress method （CUMS）. Post-surgery， rats received treatment of APS 200 mg/（kg·d） （APS low dose group）， APS 400 mg/（kg·d） （APS high dose group） and equal volume of saline （model control group and blank control group） for 4 weeks by gavage. Results from the behavioral and electrophysiology experiments， and the level of protein and gene expressions of nuclear factor-κB （NF-κB） and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma （PPAR-γ） in hippocampal CA1 region were analyzed to determine the effect of APS on PSD in rats. Results Compared with the model control group， the APS low dose group and the APS high dose group showed significantly lower spontaneous action potential （AP） and group peak potential （PS） voltages in the CA1 region by patch clamp recordings， significantly lower NF-κB protein and mRNA expression and significantly higher PPAR-γ protein and mRNA expression， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The saccharification water intake experiment showed that the sucrose intake of the two APS dose groups were significantly higher than those of the model control group， the water maze test showed that the escape latency of the rats in the two APS dose groups were significantly shortened and number of platform crossings were significantly increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The changes of the above parameters in the APS high dose group were more obvious than those in the APS low dose group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion APS may play a therapeutic role in PSD by inhibiting the phosphorylation of NF-κB signaling pathway and stabilizing the AP and PS voltages in the hippocampal CA1 region.

[Key words] Rat; Astragalus polysaccharide; Post-stroke depression; Potential; NF-κB signaling pathway; Phosphorylation

脑卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）属于脑卒中后继发性心境障碍性疾病，具有发病率、致残率、死亡率高的临床特点[1-2]。研究表明，脑卒中2周后27.47%的患者会出现不同程度的抑郁，PSD会延迟卒中后神经功能的恢复，并可能增加卒中复发率和病死率[3]。丘脑、海马、基底节、额叶及颞叶均为PSD好发病灶[4-5]。研究表明，核转录因子-κB（NF-κB）磷酸化反应与PSD的发生相关[6-7]。抑制NF-κB信号通路磷酸化反应可减轻PSD模型大鼠抑郁症状，电刺激可显著降低其前额叶皮层中的NF-κB[8]。由此可见，NF-κB活性与PSD密切相关[9]。有动物实验表明，降低大鼠海马CA1区自发性动作电位（AP）和群峰电位（PS）电位电压后PSD模型大鼠的抑郁症状明显好转[10]。上述诸多研究均说明，纠正脑海马CA1区异常放电，抑制NF-κB信号通路磷酸化反应可能有利于PSD的康复。而黄芪多糖（APS）具有良好的营养神经作用，对改善不同类型的神经损伤、恢复神经功能具有明显促进作用[11]。因此，系统研究APS对NF-κB信号通路及海马CA1区电活动的影响对开发新药用于临床治疗PSD有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级健康雄性Wistar大鼠，月龄38～42 d，体重170～190 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，在湖北省十堰市太和医院（以下简称“我院”）生命科学研究所实验室饲养并进行实验，实验动物设施使用证：SYXK（鄂）2016-0031，实验动物质量合格证：SCXK（鄂）2016-008。将采用旷场实验筛选合格的48只Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、APS低剂量组和APS高剂量组，每组12只。实验中遵守3R原则，给予动物人道关怀并使之充分享受动物福利，福利伦理审查证号：湖北医药学院动（福）第2018-1号。

1.2 药品与设备

APS（北京索莱宝科技有限公司，批号：SA9790）;Morris水迷宫（上海洛维生物科技有限公司）;Morris水迷宫视频分析系统（版本：XR-XM101，成都泰盟软件有限公司）;过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）和NF-κB试剂盒（上海超研生物科技有限公司，批号：H1425、H1427）。

1.3 大鼠PSD模型建立与治疗

除空白对照组外，模型对照组、APS高剂量组和APS低剂量组均采用线栓法构建大鼠局灶性脑缺血模型，术后3周内每天随机选取以下应激性刺激中的2种（禁食17 h，禁水17 h，倾斜鼠笼45° 17 h，湿笼21 h，4℃冰水游泳5 min，水平高速振荡5 min，夹尾1 min，夜间灯光照射、白天暗室使动物昼夜活动颠倒）并结合孤养的方法建立大鼠PSD模型[12]。利用大鼠对糖水嗜好的特点模拟人类的兴趣感，糖水饮用量下降则反映出受试动物内源性抑郁核心症状即快感缺失，3周后以大鼠糖水消耗量逐步降低、探究性和自发性活动减少、对外界不可预知刺激的被动躲避缺陷为造模成功标准[13]。本研究中，参考人与动物体表换算公式计算得出大鼠的用药剂量为200～400 mg/（kg·d）。APS高剂量组和APS低剂量组分别用200 mg/（kg·d）和400 mg/（kg·d）APS灌胃（1次/d），空白对照组和模型对照组等量生理盐水灌胃作为对照（1次/d），四组大鼠共治疗4周。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 行為学及学习能力观察  治疗结束后，采用糖水摄取实验观察大鼠抑郁行为;采用Morris水迷宫实验评价大鼠学习能力。利用Morris水迷宫视频分析系统记录和分析各组大鼠进入（穿越）次数和逃避潜伏期以评价大鼠学习能力。越台次数越多、逃避潜伏期越短则提示所试动物学习和记忆能力提高。

1.4.2 膜片钳技术检测海马CA1区AP和PS电压  断头处死大鼠后迅速取出脑组织，用振动切片机连续切成脑薄片（300 μm）。然后将脑薄片置于37℃饱和人工脑脊液中孵育1 h，孵育后用膜片钳放大器记录脑薄片CA1区AP和PS电压。

1.4.3 Western blot检测海马CA1区脑组织NF-κB及PPAR-γ水平  取大鼠海马CA1区脑组织制成组织匀浆液，离心力调到3000 g，离心半径为10 cm，离心15 min，取上清提取总蛋白，SDS分离，PVDF脱膜。加兔抗人NF-κB抗体，用封闭液将一抗按1∶5000稀释，将膜与一抗共孵育，然后4℃过夜。用TBST洗膜，共2次（10 min），然后用封闭液稀释HRP标记的二抗（1∶3000），将稀释后的二抗与膜共同孵育45 min。TBST洗膜，共4次（15 min）;采用HRP-ECL化学发光法发光显影，然后用凝胶图像分析系统进行信号分析，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白产物相对量。PPAR-γ检测步骤同上。

1.4.4 RT-PCR检测海马CA1区脑组织NF-κB及PPAR-γ的mRNA水平   用DNAMAN引物设计软件设计引物序列，其中NF-κB mRNA上游引物：5′-AGACACTCCAGCTCCGTGCTAC-3′，下游引物：5′-GATC-GCGGTGGTACGTGCG-3′。PPAR-γ mRNA上游引物：5′-AGCCACTCCGAGTACATCTTGC-3′，下游引物：5′-ATCTCTAACATCAGGTGTC-3′。GAPDH上游引物：5′-ACCTCGGATCCGTGCGATGTAC-3′，下游引物：5′-A-GTACCTCTCGCCTACTAC-3′。RNA抽提试剂盒提取脑组织标本总RNA，然后逆转录，以GAPDH为内参进行PCR扩增，然后对NF-κB和PPAR-γ基因进行半定量分析。以NF-κB和PPAR-γ灰度值/GAPDH灰度值表示NF-κB mRNA和PPAR-γ mRNA的相对值（/GAPDH）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计分析软件处理实验数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间检验先进行多因素方差分析，符合正态分布的组间两两比较采用LSD-t检验，不符合正态分布的组间比较采用校正LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗后四组NF-κB、PPAR-γ的蛋白及mRNA相对表达值比较

与空白对照组比较，模型对照组NF-κB蛋白及mRNA均高表达，而PPAR-γ蛋白及mRNA均低表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，治疗后APS低剂量组和APS高剂量组PPAR-γ蛋白及mRNA显著升高，NF-κB蛋白及mRNA显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）;与APS低剂量组比较，APS高剂量组PPAR-γ及NF-κB的蛋白及mRNA水平变化更明显，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

表1   治疗后四组NF-κB、PPAR-γ的蛋白及mRNA相对表达值

比较（x±s）

注：与空白对照组比较，aP < 0.05;与模型对照组比较，bP < 0.05;与APS低剂量组比较，cP < 0.05;PPAR-γ：过氧化物酶体增殖物激活受体-γ;NF-κB：核转录因子-κB;APS：黄芪多糖

2.2 治疗后四组海马CA1区AP、PS电压变化比较

与空白对照组比较，模型对照组海马CA1区AP、PS电压明显升高（P < 0.05）。与模型对照组比较，APS低剂量组和APS高剂量组CA1区AP和PS电压明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。APS高剂量组较APS低剂量组CA1区AP、PS电压降低更明显（P < 0.05）。见表2。

表2   治疗后四组海马CA1区AP、PS电压变化比较（mV，x±s）

注：与空白对照组比较，aP < 0.05;与模型对照组比较，bP < 0.05;与APS低剂量组比较，cP < 0.05;APS：黄芪多糖;PS：群峰电位;AP：动作电位

2.3 行为学及学习能力观察结果

糖水摄取实验结果显示，模型对照组大鼠糖水摄取量较空白对照组明显减少（P < 0.05）;在定位航行试验中，与空白对照组比较，模型对照组大鼠逃避潜伏期明显延长，越台次数明顯减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，APS低剂量组和APS高剂量组逃避潜伏期缩短，越台次数及糖水摄取量明显增多，差异有统计学意义（P < 0.05）;与APS低剂量组比较，APS高剂量组各项指标变化更明显（P < 0.05）。见表3。

表3   四组大鼠Morris水迷宫及糖水摄取实验结果比较（x±s）

注：与空白对照组比较，aP < 0.05;与模型对照组比较，bP < 0.05;与APS低剂量组比较，cP < 0.05;APS：黄芪多糖

3 讨论

黄芪味甘性微温，其主要化学成分为APS[14]。具有抑制氧化应激损伤及神经保护作用[15-16]。研究表明，NF-κB高激活与PSD病情加重有关，NF-κB信号通路主要介导组织损伤、应激、防御反应等重要信息的传递，参与缺血性脑卒中血管壁炎性反应[17-18]。PPAR-γ可抑制NF-κB的磷酸化反应，降低高激活状态的NF-κB引起的缺血性脑卒中血管壁炎性反应，间接起到对神经元的保护作用[19]。本研究中，APS低剂量组和APS高剂量组NF-κB蛋白及mRNA低表达，而PPAR-γ蛋白及mRNA明显高表达，这提示APS可能通过提高PPAR-γ活性来抑制NF-κB的磷酸化反应以降低NF-κB活性。这与王煜等[20]的研究结果相符。因脑组织持续性缺血缺氧会导致钠氢通道开放，而钠氢通道对维持细胞内pH值以及细胞内环境稳态至关重要。过度开放的钠氢通道会导致细胞内Na+超载，进而激活Na+-Ca2+通道，造成细胞内Ca2+超载，这是造成PSD患者神经细胞损伤的离子基础[21]。膜片钳记录到模型对照组海马CA1区AP、PS电压较空白对照组明显升高可能与此有关，而经APS治疗后，APS低剂量组和APS高剂量组CA1区AP、PS电压均较模型对照组明显降低，这一结果也印证了这一推论。提示APS可维持PSD后CA1区膜电压稳定性，使Na+-Ca2+、Na+-H+交换维持于正常水平，纠正Ca2+超载，保证细胞内pH值和Ca2+水平的平衡有关，这对防止细胞酸中毒、促进神经细胞功能恢复有重要意义。APS低剂量组和APS高剂量组糖水摄取量较模型对照组明显增多，大鼠的逃避潜伏期明显缩短且穿台次数明显增多，提示经APS治疗，大鼠抑郁行为减轻，学习能力增强。这一治疗作用也是上述多因素相互作用的结果。

综上所述，APS可减轻PSD大鼠抑郁并提高其学习能力，其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路的磷酸化反应，稳定脑海马CA1区AP和PS电压而发挥对PSD的治疗作用。这一研究结论对开发新药用于临床治疗PSD有一定的参考价值。

[参考文献]

[1]  杨莹莹，潘永惠，王森，等.脑卒中后抑郁的研究进展[J].医学研究杂志，2016，45（4）：168-170.

[2]  张丹，张春红，马会靖，等.中医疗法预防脑卒中后抑郁有效性的系统评价[J].中国中医急症，2017，26（4）：577-580，628.

[3]  王强，郭阳，刘瑶，等.耳穴贴压治疗脑卒中后抑郁的Meta分析[J].中国医药导报，2018，15（4）：103-107.

[4]  黃武言，李伟，张春红，等.脑卒中后抑郁病灶研究进展[J].中国老年学杂志，2017，37（6）：1554-1556.

[5]  李玥，贺敏，张磊阳，等.抑郁症神经解剖及其病理机制的研究进展[J].安徽医药，2017，21（10）：1751-1759.

[6]  兰晶，李耀彩，张其梅，等.核因子-κB与缺血性脑卒中[J].临床内科杂志，2005，22（11）：788-789.

[7]  隋汝波，张磊，臧丽娥，等.恩必普软胶囊对脑卒中后抑郁大鼠海马细胞因子及NF-κB的作用[J].中国新药杂志，2011，12（11）：1025-1029.

[8]  蒲荣，邵润慧，卢峻，等.针刺对抑郁大鼠前额叶皮层核转录因子κB、诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮表达的影响[J].针刺研究，2018，12（4）：78-91.

[9]  杨坤，于雪.S100B和ERK-NF-κB信号通路的抗抑郁作用机制[J].神经疾病与精神卫生，2014，14（6）：624-627.

[10]  王春方，孙长城，明东，等.脑卒中后抑郁患者脑电信号长电位相关性分析[J].仪器仪表学报，2017，38（6）：1361-1367.

[11]  向艳霞，肖凌云，张菊，等.黄芪多糖治疗神经系统疾病的作用及其机制研究进展[J].中国医院药学杂志，2016， 36（8）：687-691.

[12]  Li Y，Yan J，Zhu X，et al. Dilated Virchow-Robin spaces in the hippocampus impact behaviors and effects of anti-depressant treatment in model of depressed rats [J]. J Affect Disord，2017，219：17-24.

[13]  刘福友，杨石，陈卫垠，等.脑卒中后抑郁大鼠模型的建立[J].中国临床康复，2006，10（42）：91-94.

[14]  朱世杰，陈瑞，梁建，等.黄芪多糖的实验研究进展[J].贵阳中医学院学报，2018，40（4）：63-60.

[15]  陈蔚，鞠婧，王浩，等.黄芪多糖抑制糖尿病心肌氧化应激的初步研究[J].中国医药导报，2018，15（9）：4-7.

[16]  郑波，陈涛，毛华，等.黄芪多糖对脑外伤大鼠学习记忆能力影响的研究[J].中医临床研究，2016，8（33）：24-26.

[17]  顾红梅，邵阳.急性脑梗死患者TLR4/NF-κB信号通路水平与脑血流量的相关性研究[J].卒中与神经疾病，2017， 24（3）：197-199.

[18]  孙爱丽，丛海涛，陈玲阳，等.炎症反应在糖尿病及心血管并发症中的机制研究进展[J].中国现代医生，2018， 56（28）：159-164.

[19]  蔡灵钰，王莉，俞春江，等.过氧化物酶体增殖物受体γ激动剂对脑缺血再灌注损伤的保护机制[J].中华老年心脑血管病杂志，2016，18（2）：218-220.

[20]  王煜，李承德，曲敬蓉，等.黄芪多糖对抑郁大鼠海马NF-κB信号通路的影响[J].中国药理学通报，2018，34（6）：836-840.

[21]  周炬，刘红亮.钠氢通道1在脑缺血再灌注损伤中的相关机制研究进展[J].重庆医学，2017，46（2）：271-227.

（收稿日期：2018-08-14  本文编辑：张瑜杰）