莲心碱对大鼠非酒精性脂肪肝组织的保护作用及机制研究

李俊雅 梁晓

【摘要】目的：研究莲心碱对非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝细胞炎症以及NF-κB、TNF-α凋亡相关蛋白表达的影响，探讨莲心碱对NAFLD的治疗作用和机制。方法：高脂饲料喂养大鼠8周构建NAFLD模型，模型构建成功后随机分为正常空白组、高脂模型组、莲心碱低剂量组和高剂量组，每组8只。喂养至12周末麻醉处死后取材，HE染色观察大鼠肝组织病理学改变情况，检测肝组织血清谷丙转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）表达水平，NF-κB、TNF-α表达情况。结果：高脂模型组NF-κB、TNF-α、ALT、TC、TG水平显著高于正常对照组（P<0.05）。相比高脂模型组，莲心碱高、低剂量组水平降低（P<0.05），且剂量越高降低越明显。结论：莲心碱可减少NF-κB、TNF-α的产生，发挥抗炎作用，从而对NAFLD引起的血脂增高和肝功能损伤起到一定保护和治疗作用。

【关键词】莲心碱;非酒精性脂肪肝;保护作用

【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2022）04-0029-04

Protective Effect and Mechanism of Liensinine on Nonalcocholic Fatty Liver in Rats

LI Junya1LIANG Xiao2

1.XiangTan Medicine and Health Vocational College， institute of medical technology， Xiangtan 411102， China;

2.Guilin Medical University， Guilin 541199， China

Abstract：Objective To observe the effects of Liensinine on the expression of NF-κB and TNF-α proteins related to inflammation and apoptosis in hepatocytes of rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）， and to explore the protective effect and mechanism of liensinine in the pathogenesis of NAFLD. Methods NAFLD model was established in rats fed with high-fat diet for 8 weeks. After the model was established， rats were randomly divided into control group， high-fat model group， low-dose group and high-dose group with 8 rats in each group. The rats were sacrificed at the end of 12 weeks after feeding. The pathological changes of liver were observed by HE staining. The expression levels of alanine aminotransferase （ALT）， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， and the expressions of NF-κB and TNF-α in serum of liver tissues were detected.Results Compared with the control group， levels of NF-κB， TNF-α， ALT， TC and TG in high fat model group were significantly increased （P<0.05）.Compared with the high-fat model group， the levels of lieninine in high-dose and low-dose groups were decreased （P<0.05）. The higher the dose， the more significant the decrease was. Conclusions Lieninine can reduce the production of NF-κB and TNF-α， and play an anti-inflammatory effect， thus playing a protective and therapeutic role in the increase in blood lipid and liver function injury caused by NAFLD.

Keywords：Liensinine; Noalcoholic Fatty liver; Protection

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是排除酒精、感染之外出现肝脏脂肪过度堆积的一种肝脏疾病。NAFLD可逐渐发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，同时还可增加糖尿病和心血管疾病的罹患风险[1-2]。随着人们饮食结构和生活习惯的改变，肥胖及代谢综合征的流行，NAFLD已经成为一種全球性的疾病，发病率在世界范围内逐年上升，发病年龄年轻化，逐渐成为影响人类健康的最常见肝病之一[3]。目前，NAFLD的发病机制复杂，国内外学者大多认为NAFLD 发病主要与氧化应激、细胞过度凋亡和过度炎症反应密切相关。NAFLD可划归于中医的“胁痛”“积聚”“癥瘕痞块”等疾病范畴。近年来中医药治疗NAFLD的疗效日益受到重视。本研究通过观察莲心碱对NAFLD大鼠肝组织NF-κB、TNF-α表达的影响，探讨莲心碱防治NAFLD的可能作用途径，为治疗NAFLD筛选有效药物提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠48只，体重（180±20）g，购于中南大学湘雅医学院实验动物中心。动物合格证号：SCXK（湘）2019-0041。

1.2试剂与仪器全自动生化分析仪（美国亚培公司），Alpha Imager 2200型凝胶成像分析系统（美国Alpha公司）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;电子分析天平（德国Sartarius公司）;HH-2型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）;高速离心机（德国Eppndorf 公司）;光学显微镜（日本Olympus公司）;ELISA试剂盒、蛋白免疫印迹系统（美国BIO-Rad公司）;WD-9405B型水平摇床（北京市六一仪器厂）。

1.3模型建立、分组及给药造模：大鼠适应性喂养3天后，随机分出8只作为8周空白组（第8周处死）和8只12周空白组（第12周处死），普通饲料喂养。其余大鼠均采用高脂饲料（基础饲料88%、胆固醇2%和猪油10%）喂养8周，随机选取8只，进行肝脏病理组织学检查以确定是否造模成功。

分组：造模成功后，将剩余24只模型大鼠随机分为NAFLD模型组、莲心碱低剂量组和高剂量组，每组8只，继续喂养高脂饲料至实验结束。

给药：空白组和模型组给予同等剂量的生理盐水，药物预处理12周后，禁食12 h，10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血约5 mL，取肝组织，-20 ℃保存备用。

1.4血清生化指标检测测定空腹血清谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT），总胆固醇（TC），甘油三酯（TG）水平。血浆静置2 h后，3000 rpm/min，4 ℃离心10 min，取上清液进行检测。

1.5病理学观察取肝脏右叶中部距边缘，剪取0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm肝组织若干块，置于10%多聚甲醛液中固定24 h，梯度乙醇洗脱后，石蜡包埋，切片（约4 cm厚度），使用苏木精-伊红染色（HE染色），光镜下观察肝组织的细胞脂肪变、炎症细胞浸润和坏死程度等病理学形态。

1.6Western Blot测定肝组织NF-κB、TNF-α蛋白表达取各组肝组织20 μg，放入加有裂解液PIRA和蛋白抑制剂PMPF混合液的EP管中，充分裂解肝组织。每个样本取出20 μL蛋白液进行蛋白定量，按目标蛋白NF-κB及TNF-α浓度配制分离胶，电泳后转至PVDF膜，取出PVDF 膜，TBST冲洗3次，封闭结束后，将PVDF膜置于1∶[KG-3/5]1000稀释的一抗溶液中，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST冲洗3次，加入1∶[KG-3/5]2000稀释的二抗溶液，室温摇床孵育1 h。等比例混合BeyoEclplus A、B液，均匀滴加在PVDF膜表面，包覆封装后放置于暗盒中，在暗室中显影曝光。显影30～70 s后用清水冲洗，定影2～3 min，漂洗干净，自然晾干。

1.7统计学方法采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析，数据以均数加减标准差（x±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析。

2结果

2.1大鼠血清生物化学指标的检测结果实验结果显示，模型组的血脂（TC、TG）和肝功能（ALT、AST）较同期空白组明显上升（P<0.01），并且8周模型组和12周模型组差异显著，存在统计学意义（P<0.05），证实高脂诱导的NAFLD模型成功致使大鼠肝细胞损伤，喂养时间越长，肝细胞损伤越严重。对比同期模型组，治疗组血清中的TC、TG和ALT、AST含量下降明显（P<0.01），但仍高于正常空白组。莲心碱治疗能降低大鼠血脂、胆固醇和肝功能方面，高剂量组最为显著。具体见表1。

2.2大鼠肝脏病理结果正常空白组肝小叶结构清晰，未见肝细胞脂肪变性及炎症细胞浸润，无明显的病理变化。模型组的肝细胞肿胀，表现出弥漫性脂肪变，内部可见数量不一、大小不等的脂滴分布，胞质出现空泡状改变，其中以中央静脉周围改变最明显。肝小叶内和汇管区被炎症细胞浸润，并且肝小叶内可观察到局灶性点或片状的坏死灶。莲心碱治疗组肝细胞小叶结构基本完整，但存在轻度水肿。与模型组相比，莲心碱治疗组肝细胞内的脂滴数量下降，炎症浸润、脂肪变性坏死程度均表现出明显改善，以高剂量组尤为明显。具体如图1所示。

2.3肝组织NF-κB及NF-α蛋白表达Western Blot检测NAFLD大鼠肝组织中NF-κB、TNF-α基因表达。相比空白组，模型组肝脏组织中NF-κB蛋白表达显著上升（P<0.01），药物治疗后，NF-κB蛋白表达有所下降，高剂量组优于低剂量组（P<0.01）;药物干预后各组TNF-α表达均不同程度降低，莲心碱高剂量组与低剂量差异明显（P<0.01），高剂量组显著优于低剂量组。具体见表2。

3讨论

ALT、AST是存在于肝细胞浆内的细胞因子，是肝脏代谢和转运功能的常见指标，当肝细胞受损时，能够进入血清中，导致血清ALT、AST水平升高， 因此，血清ALT、AST水平的高低是肝损伤的测定指标[4-6]。本研究构建的模型大鼠血清ALT、AST 水平升高，肝脏指数升高，肝组织中 TG、TC 水平升高，说明成功构建了NAFLD大鼠模型。TNF- α是一种肝损伤早期出现的一种促炎因子，可以诱导Kupffer细胞合成大量的白介素，导致中性粒细胞聚集，引起肝脏炎症和损伤[7-8]。而 NF-κB是机体内调控促炎细胞因子（TNF-α等）的转录与合成的关键调控因子。所以，通过NF-κB信号通路调节机体免疫炎性反应，可以积极改善肥胖所致NAFLD。

莲心碱主要是從中药莲子心中提取分离得到的生物碱。莲在我国各地均有栽培，主产于湖北、浙江、江西、福建、湖南等地[9]。现代药理学研究[10]表明莲具有调脂减肥、降血糖、抗氧化、抗病毒、抑菌抗炎、抗焦虑和抗抑郁等作用。杨丹虹等[11]发现莲的提取物通过改善肝细胞脂变，可以拮抗高脂高糖所导致的NAFLD。史霄燕等[12]发现莲心碱能够明显抑制多种诱聚剂诱导的高脂血症患者，治疗高脂血症。范婷婷等[13-14]认为莲总生物碱能抑制前脂肪细胞3T3-L1的增殖，调节脂代谢紊乱，从而控制体重、预防肥胖的功效。

本实验采用高脂饮食构建NAFLD大鼠模型，12周高脂喂养后，发现大鼠肝组织TC、TG、ALT和AST水平和NF-κB、TNF-α表达及血清明显上升，肝脏病理学出现脂肪变化，炎症加重。本研究用不同剂量莲心碱对NAFLD大鼠模型进行干预，结果显示： 莲心碱尤其是高剂量组可能通过降低NF-κB、TNF-α的表达，减少炎症因子的释放，进而减少肝细胞损伤，显著降低血清ALT、AST 水平，对血清TC、TG水平也有一定程度的降低，肝脏病理学改变也显示肝小叶内脂肪变细胞减少、缩小及炎症、坏死细胞减少、消失。实验结果也表现出量效依赖性，但量效关系中最佳治疗剂量的确定以及药物的安全性尚需进一步研究。

综上所述，莲心碱能够减轻NAFLD大鼠肝组织损伤，其作用机制可能与抑制炎症反应有关，莲心碱可能是治疗NAFLD的有效药物。

参考文献

[1]钟燕，苏淑婷.非酒精性脂肪性肝病治疗研究进展[J].实用肝脏病杂，2019，22（1）：145-148.

[2]EDREES N E， GALAL A A A， ABDEL MONAEM A R， et al. Curcumin alleviates colistin-induced nephrotoxicity and neurotoxicity in rats via attenuation of oxidative stress， inflammation and apoptosis[J].Chem Biol Interact， 2018 （294）：56-64.

[3]CHAO H W，CHAO S W，LIN H，et al. Homeostasis of glucose and lipid in non-alcoholic fatty liver disease [J]. Int J Mol Sci， 2019， 20（2）. 298.

[4] POPOV V B， LIM J K. Treatment of nonalcoholic fattyliver disease ： the role of medical， surgica，and endoscopic weightloss[J].J Clin Transl Hepatol， 2015， 3 （3）： 230.

[5] ELMAKKI  E， AQEEL Y H， BANI I， et al. Nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） in Saudipatients with T2D MinJazanregion： prevalence and associated factors [J].Br J Med Med Res， 2015， 5（7）： 872.

[6] WANG S， ZHANG J， ZHU L， et al . Association between liver function and metabolic syndrome in Chinese men and women[J]. Sci Rep ， 2017，7（1）：44844.

[7] XIN C，YONG S，RENA L. Targeting TNF： a therapeutic strategy for Alzheimers disease[J].Drug Discov Today，2014， 19 （11）： 1822-1827.

[8] RUBIO-PEREZ J M，MORILLAS-RUIZ J M. A review： Inflammatory process in A lzheimers disease，role of cytokines[J].Scientific World Journal，2012，20（2）： 756357.

[9] GUO H B. Cultivation of  lotus （Nelumbo nucifera Gaertn. ssp. nucifera） and its utilization in China [J]. Genet Res Crop Evol， 2009， 56（3）： 323-330.

[10] RAJPUT M A， KHAN R A. Phytochemical screening， acute toxicity， anxiolytic and antidepressant activities of the Nelumbo nuciferafruit [J]. Metab Brain Dis， 2017，32（3）：743-749.

[11] 楊丹虹，楼招欢，程斌，等.荷叶对高脂高糖致NAFLD大鼠炎症因子水平及AdipoR2表达的作用研究[J].中国中药杂志， 2016， 41（18）： 3406-3411.

[12] 史霄燕，胡文淑.甲基莲心碱对高脂血症患者及健康成人血小板聚集的影响[J].中国药理学通报， 1998，14（3）： 49-51.

[13] 范婷婷，法鲁克，方芳，等.荷叶总生物碱降脂减肥作用的体内外试验[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2013， 39（2）：141-148.

[14] 范婷婷.荷叶生物碱类物质降脂减肥活性研究[D].杭州：浙江大学，2013.

（收稿日期：2021-07-06编辑：刘斌）

基金项目：湖南省教育厅科学研究项目（项目编号：19C1798）。

作者简介：李俊雅（1983- ），女，汉族，硕士，副教授，研究方向为中药化学成分和药理作用。E-maiL：lijun19831016@163.com

通信作者：梁晓（1981-），男，汉族，博士，副教授，研究方向为中药有效成分及其作用机制研究。E-maiL：liangxiao5680@163.com