浒苔蛋白核的显微观察

王建柱，马永刚，方 静

（1.恒帆医药科技（泰州）有限公司；2.泰州职业技术学院；3.泰州市药品检验院，江苏 泰州 225300）

浒苔Enteromorpha prolifera(Müller)J.Ag.又称青苔，属于绿（Chlorophyta）、绿藻纲（Chlorophyceae）、石莼目（Ulvales）、石莼科（Ulvaceae）、浒苔属（Enteromorpha（Link）Ag.）。藻体管状，膜质，细胞单层，主枝明显，分枝细长，可达2m。浒苔是我国海洋野生植物中极为丰富的大型经济绿藻类，它广泛地分布于海洋沿岸中、低潮区的砂砾、岩石、滩涂和石沼中，尤其在东南沿海一带分布广泛。浒苔藻色鲜艳，味道鲜美，营养价值较高[1]，含有许多人体所必需的营养成份[2]，自古以来即分为食用和药用藻类。在我国《食物营养成分表》上记载：浒苔含铁量为我国食物中之最。《随息居饮食谱》记载：浒苔“清胆，消瘰疠瘿瘤，泄胀、化痰，治水土不服”，《本草纲目》记载浒苔有“烧末吹鼻止衄血；汤浸捣敷手背肿痛”，浒苔对Ehrlich癌和皮肤癌有显著的抑制活性[3]，据报道浒苔具有明显的降低胆固醇、降血脂[4]和抗衰老作用。除食用及药用外，浒苔还被广泛地应用于化工、纺织和国防工业。目前国内外藻类学者对于绿藻的蛋白核研究并不多。该研究对于浒苔的光合作用、生活史的研究、浒苔抗肿瘤药物研发等方面具有重要理论和实践意义.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 浒苔取材 本实验的浒苔样品均采自江苏东台紫菜育苗基地紫菜筏架。所取浒苔样品装于附有冰块的漂沫保鲜盒中运回实验室。挑选新鲜、宽大藻体用无菌海水冲洗，去除表面杂藻和原生生物，在PES培养液中，15℃条件下培养，备用。

1.1.2 培养液与试剂 （1）试剂。江苏启东港附近黄海海域的海水经沉淀、暗处理煮沸后备用；NaNO3；甘油；磷酸钠；Fe；EDTA；硫酸素（Thiamine）；钴胺素（VB12）；Tris；卡诺固定液I（甲醇：冰醋酸=3∶1）；卡诺固定液II（乙醇：冰醋酸=3:1）；盐酸；苏木精；二甲苯；三级水。

（2）培养液（见表1）。

表1 PES培养基母液

1.1.3 试验仪器 光照培养箱（HPG-280H人工气候箱）、移液器（Finnpoipette Digital 1～5ml，200～1000μl，40～200μl）、pH计（METTLER TOLEDO实验室pH计EL20）、盐度计（VR-212 Salinity ATC 0～28%）、加热器（HB-032金属恒温加热器）、显微镜（Olympus BH-2显微镜）、相机（Olympus PM-C35DX）。高温灭菌：锥形瓶（250 ml），盖玻片，载玻片，毛笔，镊子，手术剪刀，培养皿（直径150mm），洗瓶，EP管，针。其他：酒精灯，牙签，打火机等。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白核染色法 本实验采用苏木精染色法[5]，此方法能使蛋白核的轮廓保持清晰，即使用它处理蛋白核类囊体数目多而不易分散的材料，也能得到较好的效果。

1.2.2 染色步骤 （1）材料培养：把材料培养到实验所需标准：藻体新鲜、宽大、无菌、无气泡、表面无杂藻和原生生物。（2）取材：进行24小时连续取材，每小时取材1次。（3）材料固定：用渗透力强的固定液将材料迅速杀死，使蛋白质沉淀并尽量使其保持原有状态。（4）光照处理：经自然光照射可以加速浒苔色素的降解。（5）材料解离：藻类细胞有细胞壁，主要成分是果胶和纤维素；胞间层含有大量果胶，这将导致压片很难达到理想的解离效果。经过稀盐酸解离，细胞之间的果胶层被破坏，细胞壁得到软化，使压片能够取得良好效果，便于染色。（6）材料染色：指用颜料对材料进行处理，以便观察和分析。本实验采用苏木精作为染料。（7）分色：醋酸可以使被染色的浒苔分色和软化。（8）压片：分涂片和常规压片。（9）镜检与拍照：在显微镜下寻找典型的浒苔蛋白核和类囊体，记录实验现象，保存试验成果。

1.2.3 实验过程 （1）材料培养：用毛笔刷去浒苔表面的杂质，先用淡水冲洗然后再用消毒海水反复冲洗，把表面干净的浒苔样品放在合适的培养环境中进行培养。注：培养环境：温度（15℃），盐度（2.4），光照（4500lx），pH（7.8）。（2）取材：在浒苔生长旺盛期进行24小时取材，每小时取材1次。将所取样品装于已编号的1.5mlEP管内，加固定液1ml。（3）材料固定：用固定液I（甲醇：冰醋酸=3:1）固定所取样品，将材料迅速杀死，分解色素体，破灭荧光物质，使蛋白质沉淀并尽量使其保持原有状态，以达到观察所需要求。一般固定24小时以上，经常加换固定液。（4）光照：通过光照的方法加速浒苔色素体的解离。（5）材料解离：用镊子将固定冲洗后的材料置于装有1mol/L盐酸的1.5ml已编号的EP管中，在60℃下解离2小时。（6）材料染色：用镊子将解离冲洗后的材料置于5%苏木精溶液中染色24小时以上。（7）分色：用镊子将染色冲洗好的材料移入45%的醋酸内进行分色和软化12小时以上。（8）压片：将材料放在预先用酒精浸泡并冷冻的清洁载玻片上，加1滴甘油冰醋酸混合液（1:1），然后用镊子迅速将材料夹到甘油冰醋酸混合液中，再用针剔去浒苔组织的部分细胞，以达到分散细胞便于观察的目的，最后盖上盖玻片进行压片。（9）镜检与拍照；将做好的浒苔片子放在Olympus BH-2显微镜下进行观察，先用低倍镜寻找浒苔细胞，然后用油镜观察浒苔细胞，寻找典型的蛋白核和类囊体，最后用Olympus PMC35DX相机进行拍照。

2 结果与分析

大多数种类的绿藻，细胞内含有一个细胞核，通常位于细胞边缘。浒苔细胞的色素体存在于载色体中，绿藻载色体和高等植物的叶绿体一样，有光合作用片层。载色体所含的色素也和高等植物基本相同，在载色体内通常还有一至数枚蛋白核，每个蛋白核内有一至数枚类囊体（如图1）。在叶绿体基质中，有许多由单位膜封闭形成的扁平小囊状的类囊体，类囊体内的色素以及中央大液泡对浒苔蛋白核的观察产生很大干扰（图1～6所示）。

图1 浒苔蛋白核中类囊体的形式 (比例尺=10μm)

浒苔藻体绿色，中空成管状。实验表明当浒苔生长旺盛时，藻体内会有气泡，浒苔会浮在培养液中。本实验在浒苔生长旺盛期进行24小时取材，每小时取材1次。结果发现：在暗周期开始后2～3h固定效果更好。这可能与浒苔在暗周期下不进行光合作用，相关酶的活性较低有关。

为了破坏色素体，本实验延长了固定时间，经常更换固定液，同时进行24小时光照。实验结果表明：当固定和光照时间在24小时以上时，浒苔细胞被杀死，色素大量溶于固定液中。因为色素的本质是蛋白质，固定液I（甲醇：冰醋酸=3:1）渗透力很强，能将材料迅速杀死，使蛋白质沉淀并尽量使其保持原有状态，而且材料死亡后，细胞内的色素见光极易分解，从而达到较好的染色效果，以利于观察。

植物材料一般在1mol/L的盐酸中60℃下解离10～20分钟。但是本实验结果表明：浒苔在60℃下酸解2小时以上时效果更好。在不加热情况下，可以把解离时间延长到24小时以上。

本实验中材料的染色是重点内容，本实验采用苏木精染色法，此方法能使染色体的轮廓保持清晰，即使用它处理蛋白核多而不易分散的材料，也能得到较好的拍照效果，利于标本长期保存。

当染色时间过长时，可以用45%的醋酸进行分色，一般染色的时间与分色的时间成正比。常规压片经常会产生气泡，在压片时点一滴油冰醋酸混合物（甘油∶冰醋酸=1:1）即可解决。

3 问题与讨论

本实验发现：蛋白核中类囊体数目n=1～4，类囊体的形态有“C”形（图1-3箭头2所示）、“U”形（图1-4箭头所示）、“S”形（图1-5箭头2、3所示）、“V”形（图1-6箭头所示）。Kapraun等认为Enteromorpha prolifera的染色体数为n=10，2n=20。但我们在显微镜下发现浒苔的染色体数目n=6～10，因此我认为浒苔可能是二倍体[6]。

浒苔细胞的细胞壁分两层，内层主要成分是纤维素，外层是果胶。这给材料的解离软化带来不便，本实验通过延长解离时间达到较好的解离效果，但是当时间过长时细胞会出现裂解现象。

浒苔属于低等植物，大量的色素体对实验的观察干扰很大。为了破坏色素体，本实验延长了固定时间，经常更换固定液，并进行24小时不间断光照。实验结果表明：固定可迅速杀死浒苔细胞，且当固定和光照时间分别在24小时以上时，色素大量溶于固定液中。同时，发现固定液I（甲醇∶冰醋酸=3∶1）对浒苔的固定效果比固定液II（乙醇∶冰醋酸=3∶1）的固定效果好；同时研究发现，材料预处理时，秋水仙素的使用对实验结果影响不明显。

材料的染色是本次实验的又一大研究重点。有文献提到了铁矾—苏木精染色法，但是本实验发现：铁矾对浒苔染色体媒染效果影响不大，当染色时间超过24小时，浒苔染色体观察的效果较好。随着染色时间的增加，醋酸分色的时间也应相应延长。实验结果表明：材料染色24小时以上时，醋酸分色在12小时左右为宜。在浒苔染色实验中苏木精的染色效果比苯酚品红好。

由于时间有限，我们只发现了已被染色的染色体在细胞边缘的黑点，这对于浒苔核型分析研究具有实践意义。在实验中还遇到了一些其他问题如：在蛋白核周围也存在一些类似染色体的黑点、整个细胞中均匀地分散着黑点，黑点数量超过20个[6]。这些问题有待于进一步探讨。