类囊体膜对光胁迫的适应机制

陈 茹，朱 丽，侯 昕

(武汉大学 生命科学学院 杂交水稻国家重点实验室, 武汉 430072)

地球上绝大多数陆生植物生活在充满变化和挑战的自然环境中，日光强度的变化幅度是惊人的，可以在一天内随机跨越好几个数量级，致使类囊体膜发生不可逆的损坏，而有毒副产物活性氧(ROS)的产生加剧了损伤程度[1]。因此，植物进化出一系列的保护机制，能够最大程度地减少损伤。这些机制包括：植物的物理避光——植物的自发避光运功，使叶片逐渐朝向顺风的方向或者阳光方向平行的方向，避免叶绿体无序运动，让植物细胞内的叶绿体重新定位，使得光照最小化来避免光损伤[2]。尽管如此，植物细胞仍然会发生光抑制。许多证据有力地证明，高光强暴露下，类囊体膜是应对光胁迫的关键[3]。

1 类囊体膜

光合作用的光反应发生在类囊体膜上，类囊体上的多种蛋白复合体和电子传递体参与了光反应的能量转化和电子传递，故类囊体膜也被称为“光合膜”。

1.1 膜脂

高等植物叶绿体的类囊体膜组分包括4种甘油酯。其中，单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)和硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)属于糖脂，而另外一种磷脂酰甘油(PG)属于磷脂[4]。MGDG和DGDG分别占总膜脂的50%和20%，两者均含高比例的多不饱和脂肪酸。基粒类囊体上MGDG/DGDG的比率高于基质类囊体。MGDG会使类囊体发生弯曲，DGDG则能够稳定类囊体膜网络[4]。SQDG含量约占类囊体膜脂的10%。虽然，PG只占类囊体膜脂的3%～10%，却是决定膜脂相变的主要因素。PG中含有叶绿体特有的脂肪酸反式十六碳一烯酸(trans-16:1)需要在光下才能合成，其含量易受外界环境条件如温度、光照等的影响[4]。

1.2 类囊体膜上的蛋白复合体

光合电子传递链有两种(图1)：1)线性电子传递链(LET, linear electron transfer)。水分子在放氧复合体中裂解，产生的电子依次经过光系统II(PSII)、细胞色素b6f复合体(Cytb6/f)和光系统I(PSI)，最后传递给烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP)，形成还原型辅酶II(NADPH)。2)环式电子传递链(CET, cyclic electron transfer)。与LET不同，在CET中没有水分子的氧化，也没有NADPH的形成。电子直接经过PSI传递给铁氧还蛋白(Fd, ferredoxin)，Fd将电子传递给质体醌(PQ, plastoquinone)，然后经Cytb6/f 传递给质体蓝素(PC, plastocyanin)，PC再将电子传递给PSI，形成一个循环[5]。

图1 类囊体膜和两种光合电子传递链(根据文献[34]修改)

PSII由外周天线蛋白、内周天线蛋白、反应中心、辅助亚基和放氧复合体构成[6]。外周天线蛋白由捕光蛋白复合体(LHCII, light harvesting complex II)组成，它们负责吸收光能并传递给内周天线蛋白CP43和CP47。随后，内周天线蛋白将吸收的光量子汇集到反应中心[7]。光反应中心由2个交叉排列的蛋白 D1、D2和细胞色素b559(Cytb559)构成。反应中心含有原初电子供体Yz、PSII反应中心色素(P680)、原初电子受体和电子传递体质体醌QA和QBC。位于PSII反应中心外部的若干小分子辅助亚基，它们可能具有稳定PSII结构的功能，具体机理还有待挖掘[7-8]。放氧复合体位于靠近类囊体腔的一侧，由PsbO、PsbP和PsbQ等3个蛋白组成，分子质量分别为33、23和17 ku。其中PsbO蛋白被称为锰稳定蛋白(MSP, manganese stablizing protein)。每个放氧复合体结合4个锰离子和1个钙离子，氯离子也可以作为放氧复合体的配体，参与氧气的释放。

Cytb6/f是一种二聚体复合蛋白，每个单体包括细胞色素f(Cytf)、细胞色素b(Cytb6)和铁硫蛋白(ISP, iron sulfur protein)[9]。Cytb6/f可以介导电子从PSII到PSI的电子转移，同时促使氢离子穿越类囊体膜而泵到内腔，依靠产生的质子浓度梯度可以驱动叶绿体中ATP的合成[9]。

PSI由天线系统、反应中心、外周蛋白和内周蛋白构成。捕光天线系统将吸收的光能传递给反应中心。反应中心包括蛋白PsaA和PsaB、反应中心色素P700、原初电子受体A0、电子受体A1、铁硫蛋白Fx和铁硫中心。PSI的基质侧含有PsaC、PsaD和PsaE 3个外周蛋白。此外，PSI中含有的小分子内周蛋白对PSI复合体的组装和稳定有着重要的意义[11]。

叶绿体ATP合酶由镶嵌在类囊体膜上的CFo和突出在类囊体膜外的CF1组成。CFo是跨膜的质子通道，CF1起催化作用[12]。ATP合酶利用跨膜质子梯度催化ADP磷酸化产生ATP。叶绿体ATP合酶偶联因子CF1复合物包含5个不同的亚基，按照分子质量从大到小排列为α、β、γ、δ和ε，化学计量比为3∶3∶1∶1∶1。其中，β亚基包含叶绿体中光氧化磷酸化过程中ATP合成的催化位点。

2 类囊体膜各组分响应光胁迫机制

2.1 膜脂

研究表明PG是引起膜脂相变的关键因素，黄瓜PG中的trans-16:1对保持LHCII的结构起着重要的作用[13]。当类囊体膜受到高光强胁迫时，trans-16:1发生降解，导致LHCII寡聚体减少，捕获的光能不能有效地传递至反应中心，捕光效率下降[4]。同时，LHCII的失活还会导致PSII的超级复合体发生不可逆解体[13]，使得PSII复合物游离，参与光修复的蛋白质得以穿过基粒到达基质类囊体进行损伤修复[14]。

另一方面，类囊体膜中蛋白质之间的相互作用受到膜流动性的支撑，膜的流动性取决于游离脂质中脂肪酸的饱和度。在某些极端强烈光照条件下，类囊体脂质发生过氧化作用，产生ROS，并破坏类囊体蛋白质复合体的结构，使其形成不可逆的聚集体。这些不可逆聚集体聚集会导致膜的流动性降低[15]。类囊体膜的流动性降低阻止了蛋白质分子的热运动，受损的PSII从堆积的基粒向基质类囊体迁移速度大大延迟。脂质过氧化作用一旦在类囊体膜中扩散，可能导致PSII的修复抑制。为避免脂质过氧化反应，类囊体会自发解堆积，促进ROS从类囊体膜中逸出，阻止光胁迫造成的伤害进一步扩散[15]。

近年来发现，类囊体膜脂的不同组分在不同的物种(高等植物和藻类)中有很大的区别，特别是在强光照射下，藻类类囊体膜脂中的带负电荷脂质的比例会不断提升，这可能与抵御高光强胁迫有关[16]。在正常光条件下生长的硅藻中，类囊体膜富含带负电荷的脂质SQDG和PG，其中最丰富的是SQDG，其浓度有时比MGDG更高。在高光强胁迫下生长的硅藻类囊体膜中，带负电荷的脂质占比可能会上升到约50%。对比高等植物和硅藻的类囊体膜脂组成，可以推测高等植物中高含量的半乳糖脂和硅藻中高含量的带负电荷脂质，分别对嵌入它们的光合大分子复合体有着不同的影响[16]。

2.2 光系统II

高强度光胁迫会引起类囊体的结构重排，促进PSII的损伤修复[17]。在高光强暴露下，类囊体腔发生膨胀，膜上的状态转换激酶7(STN7, state transition 7)介导外周天线蛋白LHCII发生磷酸化修饰[18]，使得LHCII从PSII上解离并与PSI结合，平衡了PSII和PSI的能量分配[19]。基质降解酶(DEG, degradation of periplasmic)和PSII相互接触，导致基质间隙的宽度增加，有利于金属蛋白酶(FtsH, filamentation temperature-sensitive H)，状态转换激酶8(STN8, state transition 8)和PSII核心磷酸酶(PBCP, PSII core phosphatase)这几个修复蛋白更好地接近基粒类囊体[20]。此外，高光下PSII核心蛋白的磷酸化与去磷酸化主要由STN8和PBCP协同调控。STN8蛋白激酶催化PSII亚基D1、D2、CP43和PsbH的磷酸化，有利于基粒类囊体向基质类囊体迁移[21]。为了有效地降解受损的PSII核心蛋白亚基，通常磷酸化的蛋白需要在PBCP的作用下去磷酸化。FtsH从基质类囊体移动到基粒的边缘，一部分也移到基粒的核心[22]。迁移基本完毕后，CP43从PSII 里释放，PSII蛋白复合体解体，之后开始重新组装[23]。PSII的重新组装分为3个步骤：1)D2招募磷酸化的D1，在CtpA、HCF-136和HCF243等蛋白亚基的协助下，将D1蛋白的C端加工成熟并结合上D2；2)招募Psb28和PAM68，促进CP47结合上D2，形成反应中心RC47，随后招募 LPA2和LPA3，将CP43组装到RC47中，形成PSII单体；3)在FKBP20-2、Deg1和Alb3的辅助下，PSII单体重新形成二聚体。

越来越多新的类囊体跨膜蛋白被鉴定和分离出来，比如HHL1(Hypersensitive to high light 1)是一个高等植物特有的叶绿体蛋白，定位于基质类囊体膜上，与PSII中的CP43和CP47两个蛋白有着直接的相互作用，主要参与PSII的高光保护和损伤修复[24]。经过高光处理后的hhl1突变体PSII活性显著降低，核心蛋白D1的降解速度加快，同时ROS水平上升明显。另外，蛋白LQY1(Low quantum yield of photosystem II 1)也是一个参与PSII损伤修复的蛋白，它与HHL1有着直接的相互作用，协同调控PSII的损伤修复[24]。

2.3 Cytb6/f蛋白复合体

Cytb6/f通过平衡LET和CET的电子流来降低光胁迫对 PSII和PSI 的损伤。在光合作用过程中，LET在光反应中产生的能量不能满足暗反应对二氧化碳固定的能量需求，因此，在暗反应过程中需要CET进行额外的能量补充。虽然CET中没有NADPH的形成，但是可以从类囊体膜向类囊体腔泵出H+，形成跨膜质子梯度来合成 ATP。从整个叶绿体的角度来看，光合电子传递链中过度的CET会导致NADPH 供给不足，进而影响暗反应的持续进行，所以高等植物细胞需要通过Cytb6/f平衡LET和CET之间的电子分配。在整个电子传递过程中，当LET占主导时，PQ/PQH2和 NADPH处于还原状态，这时Cytb6/f能响应这种还原状态，并改变其在类囊体膜上的位置，形成 Cytb6/f-PSI 复合体，控制LET和CET之间的电子分配平衡[26]。

另一方面，外界光强的不断变化使PSI和PSII常常处于不同的激发态。状态I指的是PSI吸收的光能增多，可诱导激发能增加，最终有利于PSI激发的状态；状态II指的是PSII吸收的光能增多，被分配的可诱导光能增加，最终有利于PSII激发的状态。高等植物叶绿体通过光合状态转换来调节PSI和PSII之间的光能分配的不平衡，以及维持光合电子传递链的氧化还原状态平衡[28]。当 PSII 相对于 PSI 处于过度激发态时，电子大量产生，使 PQ/PQH2处于高还原态，导致Cytb6/f类囊体侧的 PQH2来不及释放，LHCII 蛋白激酶被激活，部分被磷酸化的 LHCII 从 PSII复合体上解离并结合到 PSI；当PSI相对于PSII处于过度激发态时，PSI的激发使还原态的PQ被氧化，Cytb6/f的Q0位点恢复正常，LHCII激酶失活，LHCII去磷酸化后从PSI解离下来再结合上PSII，还原为状态I。

状态转换可维持光合电子转移链的氧化还原。它由Stt7/STN7蛋白激酶介导，该蛋白激酶在还原质体醌池后通过Cytb6/f激活。在衣藻中，Stt7/STN7激酶可以与Cytb6/f相结合[29]。Stt7/STN7与Cytb6/f之间的相互作用是通过Rieske蛋白(PetC)发生的。酵母双杂交的试验结果表明，PetC的第51至97个氨基酸残基是与Stt7/STN7的N末端相互作用的位点。另外，Stt7/STN7与Cytb6/f的结合方式可能不止1种，比如两个Stt7/STN7单体可以与Cytb6/f的二聚体相互作用。Stt7/STN7也能通过Cytb6/f中的植酸尾巴接近Q0位点的单个叶绿素a分子来感知PQH2与Q0位点的结合。Cytb6/f表面靠近叶绿素的几个位点可以通过脂类的介导形成1个适合与Stt7/STN7互作的接触面[29]。Stt7/STN7的激活将通过Stt7/STN7所形成的二聚体中间的二硫键来触发，将信号传送至类囊体膜基质一侧，与此同时，PetC在Cytb6/f的内部来回不断移动，反复将Stt7/STN7激活。另外，在LHCII的磷酸化过程中，Stt7/STN7与Cytb6/f的结合逐渐加强，并趋于稳定[29]。

2.4 光系统I

当植物受到高光强胁迫时，过量的光量子会诱导光抑制的发生[30]。PSI的受体端吸附着大量的氧化酶类，它们通过光合电子传递链在叶绿体中产生单线态氧和超氧阴离子等，通过酶促与非酶促反应产生过氧化氢，过氧化氢在有还原态金属离子存在情况下会转化成为羟基自由基(·OH)，对PSI造成破坏[30]。为了防止类囊体膜中产生过量的ROS，需要跨类囊体膜建立质子梯度，以抑制光合电子传递链的过度还原状态。研究表明，拟南芥ATP合酶突变体hope2中由于抑制了跨膜H+梯度的形成，与野生型相比PSI在光照下更加脆弱，更易遭受光抑制[31]。这表明，为了抑制PSI中ROS的产生，叶绿体ATP合酶可通过调节类囊体膜上的氢离子通量来调节光合电子传递链的氧化还原状态[31]。另一方面，光合电子传递链中的梅勒(Mehler)反应，即假环式电子传递(PET, pseudocyclic electron transport)，对PSI也有光保护作用，即一分子氧在PSI还原侧被PSII中由水的光解形成的电子还原，重新形成两分子水，清除了超氧化物和过氧化氢，同时消耗PSII激发能和PSI中的电子，从而使PSI保持在相对氧化的状态，保护其免受破坏。

2.5 ATP合酶

芸苔属植物的叶绿体中CF1-β亚基有56 ku和54 ku 2种[32]。这两种小亚基在叶绿体发育的过程中与在成熟的类囊体膜中共存。LiDS-PAGE结果表明，56 ku是 CF1-β亚基的主要亚型。但是，在高光强胁迫下，54 ku CF1-β显著增加，高光强处理8～10 h后，含量增加了9倍[32]。因此推测，54 ku CF1-β亚型蛋白是响应高光强胁迫的。ATP合酶的激活会降低整个类囊体膜的质子梯度，并增强PSII和PSI之间的能量传导。因此，54 ku CF1-β亚型的过度积累可能是一种防止类囊体腔和细胞质子化过度的调节途径[33]。故有理由推测，在光胁迫的应答过程中，54 ku CF1-β蛋白的积累可能对减轻类囊体管腔的过度质子化有着积极的作用[33]。

3 总结与展望

当植物暴露在光胁迫条件下，类囊体膜上的膜脂和蛋白组分能够快速响应，并帮助植物适应这种逆境环境。膜脂依赖自身的流动性和trans-16:1改变大分子的聚集程度，影响受损蛋白向修复场所——基质类囊体的迁移；PSII核心蛋白复合物则主要响应磷酸化与去磷酸化过程，参与PSII的损伤修复；Cytb6/f一方面能平衡LET和CET电子流，另一方面还能参与光合状态转换介导能量的不均匀激发；PSI可以通过光保护来抑制ROS产生，阻止氧化损伤加剧；ATP合酶则依赖类囊体膜的质子梯度介导能量在PSII与PSI的传导，保证能量传导的均一性。综上所述，类囊体膜脂和蛋白复合体能帮助植物快速适应高光环境。

叶绿体类囊体膜的膜脂和蛋白质复合体一直是光合作用研究的热点。目前，有关叶绿体类囊体膜系统的主要4种高丰度蛋白复合体的研究已经较为详细，但叶绿体类囊体大量未知小蛋白亚基还有待研究[34]。在植物细胞中不同种类的蛋白质的丰度差异非常明显，变化范围可达多个数量级。很多类囊体膜蛋白具有低丰度、疏水性等特点，在很大程度上给膜蛋白的富集提取和分离鉴定带来了困难。这些低丰度膜蛋白往往发挥某些重要的生理功能，比如，位于PSII反应中心外部的小分子辅助亚基和PSI中含有的小分子内周蛋白，它们可能对光合蛋白复合体的组装和稳定有着重要的意义，具体的机理还有待挖掘。同时，在高丰度蛋白干扰的情况下，增加了对低丰度蛋白的检测和深入研究的困难。随着膜蛋白提取技术的升级和蛋白质检测技术的进步，更多的低丰度蛋白会被鉴定和解析，植物的光适应机制和调控网络也会更加清楚，最终为作物的遗传改良和人工光合奠定理论基础。