雷珠单抗球内注射治疗视网膜静脉阻塞并发黄斑水肿血清细胞因子变化及意义的研究

单俊杰，缪丽萍，叶 军，曹国平

（泰州市人民医院 眼科，江苏 泰州 225300）

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是继糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）之后第二大最常见的视网膜血管疾病，黄斑水肿（macularedema，ME）是RVO常见的并发症，是RVO患者视力受损的主要原因之一。促血管生成细胞因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）被认为是导致视网膜疾病中血管渗漏的主要因素，导致ME的形成。与VEGF一样，各种炎症因素也被认为参与了RVO-ME的发病机制[1,2]。许多研究表明RVO-ME患者玻璃体中VEGF、白细胞介素（interleukin，IL）-8、IL-6、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor，b-FGF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平显著升高[3,4]。

抗VEGF治疗已被广泛应用于临床，并被证明是治疗视网膜血管疾病的有效途径。雷珠单抗（Lucentis）是单一的含有对人源性VEGF-A发挥靶向作用的单克隆抗体Fab片段，并阻碍血管内皮细胞增殖，避免新生血管生成，消除水肿和炎症反应的作用，短期内可显著减轻黄斑水肿的程度，提高患眼视力。雷珠单抗的眼部ME治疗还存在复发、耐药性、药品的价格高、药品使用次数多、治疗时间间隔不确定等问题。因此基于雷珠单抗治疗的现状，制定适合患者的个体化治疗是临床医学发展的方向。研究一种有效预测RVOME发病风险、评估抗VEGF治疗后视力的方法成为抗VEGF治疗RVO并发黄斑水肿所需要面对的一个重要问题。目前未见有对RVO-ME患者抗VEGF治疗前后血清中炎症相关细胞因子的系统研究，因此，我们测量了RVO-ME患者血清中IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17A，IL-1b，IL-12p70，TNF-a，干扰素-γ（interferonγ，IFN-γ），IFN-a，VEGF，血管生成素II（angiopoietin II，ANG-II）等14种炎症相关细胞因子的水平，以确定RVO患者血清中炎症因子水平是否与抗VEGF治疗的预后相关。

1 对象和方法

1.1 对象本研究经过医院伦理委员会批准（KY202004301），且患者及家属均同意治疗并签署治疗同意书。随机选取2021年1月至6月在江苏省泰州市人民医院眼科就诊确诊的RVO继发黄斑水肿患者20例20眼（男11例，女9例，平均年龄61.50±15.49，21～79岁），对照组为健康体检者20例。入组标准为:（1）通过详细的症状、体征、最佳矫正视力（best corrected visual acuity，BCVA）、眼压、裂隙灯、间接眼底镜、眼底彩照、光学相干断层扫描技术（optical coherence tomography，OCT）、荧光素眼底血管造影术（fluorescein fundus angiography，FFA）检查确诊RVO，并伴有明显的黄斑水肿（CMT≥300μm）;（2）首次诊断为RVO-ME，并接受玻璃体内注射0.05ml雷珠单抗，并按要求参加所有随访。排除标准如下:（1）视网膜新生血管和/或新生血管性继发性青光眼;（2）DR、青光眼或其他严重损害视力的眼部疾病;（3）眼科手术史。

1.2 方法

1.2.1 手术方法 手术在标准层流手术室进行，患者仰卧位，内眼手术常规消毒、铺巾后，开睑器打开患眼睑，奥布卡因表面麻醉2次，稀释后的聚维酮碘浸泡结膜囊1分钟，避开角膜，生理盐水冲洗结膜囊2次，专用针头抽取10mg/mL雷珠单抗0.05mL（0.5mg），更换无菌针头，避开球结膜的血管于角巩膜缘后3.5或4mm处即睫状体平部穿刺注射，去除针头后，立即用无菌棉签压迫1分钟，检查注射眼眼压、有无光感、瞳孔对光反应情况，观察无活动性出血及玻璃体嵌顿等后遮盖术眼至次日。所有患者手术均顺利，无术中眼压升高及前房穿刺操作，无其他术中及术后并发症的出现。术后予以左氧氟沙星滴眼液4次/日，点术眼7天。定期复诊。

1.2.2 检测方法 所有患者于治疗前，治疗后1周、2周、1月分别用EDTA抗凝管采集静脉血样本（3～5ml），样本采集后的30分钟内于4℃，1000xg离心15min，分离血浆，然后在-80°C下冷冻储存。

采用ELISA方法检测血清中VEGF（Human VEGF-A ELISA试剂盒，ELH-VEGF-1,广州瑞博奥生物科技股份有限公司）、ANG-II（人血管生成素II ELISA试剂盒，DG11462H,北京冬歌博业生物科技有限公司）水平，采用流式细胞仪（细胞因子联合检测试剂盒，20210301，Cytek DxP Athena，江西赛基生物科技有限公司）检测血清中IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17A，IL-1b，IL-12p70，TNF-a，IFN-y，IFN-a的表达水平。

1.2.3 统计学分析 采用SPSS 25.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）软件进行统计分析，以P＜0.05作为差异有统计学意义。本研究中的定量资料不满足正态性，以中位数（四分位数间距）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，治疗前后比较采用相关样本的Friedman检验。RVO的影响因素分析以是否为RVO为因变量，以具有统计学差异的相关因子（采用向前：有条件法进行自变量的筛选）为自变量，进行Logistic多因素回归分析。

2 结果

2.1 RVO组与健康对照组血清细胞因子水平的比较RVO组的血清IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、IFN-a、VEGF基线水平均显著高于健康对照组，且差异具有统计学意义。RVO患者血清中的IFNγ和ANG-II基线水平也高于健康对照组，但差异未见统计学意义。具体见表1。

表1 RVO组与对照组细胞因子的比较

2.2 RVO的影响因素分析RVO的影响因素分析以是否为RVO为因变量，以具有统计学差异的相关因子（采用向前：有条件法进行自变量的筛选）为自变量，进行Logistic多因素回归分析（表2）。结果表明，IL-8（OR=1.30，95%CI：1.01～1.68）和VEGF（OR=1.16，95%CI：1.00～1.35）是RVO发生的独立危险因素。

表2 RVO影响因素的logistic回归分析

表3 治疗前后疗效和相关因子的变化

2.3 RVO组治疗前后相关因子的变化研究组检测了RVO组在抗VEGF治疗前以及治疗后1周、2周、1月的最佳矫正视力（BCVA）、中心视网膜厚度（CMT）以及相关炎症因子水平。相较治疗前0.10（0.05～0.25），RVO患者的视力在抗VEGF治疗后有了明显的提高，治疗后1周：0.20（0.10～0.50）、治疗后2周：0.30（0.16～0.50）、治疗后1月：0.30（0.20～0.49）。RVO患者CMT治疗后也有了明显下降，由治疗前的576.00μm（449.50～653.00）依次下降为314.00μm（284.00～397.50）、 282.00μm （237.00～342.00）、271.00μm（241.50～297.00）（图1）。接 受 抗VEFG治疗后，RVO组患者血清VEGF的表达量也呈现逐步下降的趋势（图2）。然而，与治疗前相比，IL-6、IL-8在抗VEGF治疗后呈现升高的趋势，且组间差异均具有统计学意义。

图1 抗VEGF治疗前后BCVA、CMT变化

图2 抗VEGF治疗前后VEGF变化

3 讨论

目前许多研究证实，在RVO患者的玻璃体或房水中，促炎因子，如IL-6、IL-8、TNF-α、VEGF等，显著上调，并与黄斑水肿的严重程度相关[4-6]。然而，较少研究关注RVO患者血清中各种炎症相关因子与抗VEGF治疗的关系。因此，本研究比较了RVO组与健康组血清相关促炎细胞因子水平，以及抗VEGF治疗前后，RVO患者的BCVA、CMT以及促炎细胞因子表达量的变化。研究结果显示，与对照组相比，RVO组患者血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、VEGF等炎症细胞因子的表达均明显升高，且差异均具有统计学意义。其中，IL-8、VEGF还显示是RVO发生的独立危险因素，在疾病的发展过程中起到了显著的作用。本研究还比较了RVO患者在接受抗VEGF治疗前，以及治疗后1周、2周、1月各项指标的变化。研究结果显示，相较治疗前，RVO患者的视力（BCVA）在治疗后显著提高，CMT以及血清VEGF表达量在抗VEGF治疗后呈现逐步下降的趋势。然而，与治疗前相比，RVO患者血清中的IL-6、IL-8在抗VEGF治疗后呈现升高的趋势。

IL-6,IL-8是一种重要的促炎细胞因子，可以直接或间接诱导各种其他炎性细胞因子的生成。被认为通过诱导VEGF的表达来增加血管通透性和新生血管生成[7]。

视网膜缺血缺氧与RVO-ME的发病机制有关。缺氧会导致血管内皮生长因子（VEGF）表达增加，大量研究认为VEGF在RVO-ME的发生及进展过程中起到关键调控作用，RVO患者玻璃体、房水中VEGF的含量较正常明显升高，且与ME的严重程度正相关[8]。

与预期相同，本研究结果显示，与对照组相比，RVO组患者血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、等炎症细胞因子的表达以及VEGF均明显升高，提示炎症在RVO中发挥重要作用，且血清与眼内液中细胞因子表达水平存在一致性。

目前，抗VEGF治疗仍是RVO-ME的一线治疗方案。针对RVO组的高VEGF水平，本研究采用了对VEGF-A亚型有较强的亲和力的雷珠单抗来进行治疗。雷珠单抗有强靶向性，可针对性地抑制VEGF-A与其受体VEGFA-1和VEGFA-2结合，阻碍血管内皮细胞增殖，避免新生血管生成，减轻水肿和炎症反应，短期内可显著减轻黄斑水肿的程度，提高患眼视力。正如本研究结果显示，相较治疗前，RVO-ME患者的视力（BCVA）在治疗后显著提高，CMT以及血清VEGF表达量在抗VEGF治疗后呈现逐步下降的趋势。

然而，抗VEGF药物对眼内炎症介质的作用似乎有限。在之前的一项研究中，球内注射贝伐单抗治疗可降低眼内VEGF浓度，而对其他炎症细胞因子的浓度没有影响[9]。Funk[10]等人研究了RVO患者接受抗VEGF治疗时眼内细胞因子浓度的变化，发现治疗后VEGF和HIF1-a浓度降低，而其他炎症细胞因子浓度未见明显改变。

本研究检测了抗VEGF治疗前后，RVO-ME患者血清中各炎症细胞因子的表达水平，结果显示大部分细胞因子表达水平未见明显改变。然而，相比较抗VEGF治疗前，IL-6、IL-8在治疗后1周、2周、1月均显示表达增加，且具有统计学意义。Agawa等[11]检测了37例老年性黄斑变性（AMD）患者房水中的23种炎症细胞因子，发现实验组玻璃体腔注射贝伐单抗2天后，VEGF水平降低，而IL-6和IL-8明显升高，推测玻璃体内注射抗VEGF药物可诱导炎症反应，增加炎症细胞因子表达水平，其相关作用机理还有待进一步研究。

本研究存在几个局限性。首先，样本量偏小，治疗后1月的失访率较高。此外，没有采集眼内液，比如房水或玻璃体样本，因此，无法研究眼内细胞因子，并将其与血清细胞因子的表达变化进行比较。

综上所述，本研究证明了RVO-ME患者的血清中炎症细胞因子明显升高。其中，IL-8、VEGF还显示是RVO发生的独立危险因素，在疾病的发展过程中起到了显著的作用。玻璃体内注射雷珠单抗可以降低VEGF的表达，减轻黄斑水肿程度（CMT）以及提高患者视力（BCVA）。研究显示抗VEGF药物对RVO-ME患者血清炎症细胞因子的作用似乎有限，但IL-6、IL-8在抗VEGF治疗后反而增加，提示璃体内注射抗VEGF药物可能通过诱导炎症反应，增加炎症细胞因子的表达水平。因此，针对RVO炎症和血管生成相关因素的进一步研究可能会导致新的治疗靶点的开发，以改善目前RVO的治疗。