胆囊结石患者血清胆汁酸谱的检测与分析*

金素丽，秘玉静，赵 帅，马利锋，沈 莉，闫国超，武 艳△

1.河北医科大学第一医院检验中心，河北石家庄 050030；2.河北医科大学第二医院普外八科，河北石家庄 050004

胆囊结石是临床上常见的一种疾病。目前，尚缺乏全国性胆囊结石的流行病学资料。有研究报道，我国胆囊结石的患病率为2.3%～6.5%[1]，个别地区的发病率甚至可达24.0%[2]，且随着人口年龄的增长和人们生活水平的提高，其发病率呈上升趋势。有研究表明，很多因素可以促进胆囊结石产生，如遗传因素、环境、性别、脂质代谢异常、胆囊功能、生活习惯、其他疾病影响等[3-4]，这些危险因素可以通过影响胆汁代谢导致胆汁成分改变或影响胆囊功能而诱发胆囊结石[5-6]。虽然目前对胆囊结石形成的危险因素已有所认识，但仍缺乏预防胆囊结石形成的有效策略[7]。胆汁酸是胆囊结石发病的重要因子，人体血清中胆汁酸各亚组分的水平变化与胆囊结石的发病及转归关系密切，临床上常用熊脱氧胆酸作为胆囊结石的治疗药物[1]。因此，胆汁酸的检测对胆囊结石的诊断及预防价值较大。以往由于技术的限制，临床上主要测定总胆汁酸水平，不能定量检测血清中不同胆汁酸代谢组分的变化。随着超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术的应用，胆汁酸代谢谱的检测在临床上的应用日渐成熟，利用其高通量的特点检测血清中胆汁酸的亚组分水平及比例，实现疾病的预防与诊断成为筛选疾病转化标志物的一种新思路。本研究通过对胆囊结石患者血清胆汁酸谱的检测，探索胆囊结石的成石原因，以期为临床诊断及早期预防胆囊结石的发生提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年9月至2020年6月在河北医科大学第一医院(下称本院)确诊为胆囊结石的患者48例作为胆囊结石组。其中男16 例，女32 例；年龄27～75 岁，平均(54.08±12.68) 岁。纳入标准：(1)经超声、CT或磁共振胰胆管成像(MRCP)诊断确诊为胆囊结石；(2)同意进行血清胆汁酸谱检测。排除标准： (1)有病毒性肝炎、酒精性肝病等肝脏损伤的病史；(2)有梗阻性胆管疾病，如结石、肿瘤等引起的胆管梗阻。48例胆囊结石患者中，总胆汁酸处于参考范围内患者32例(总胆汁酸正常组)，总胆汁酸高于参考范围16例。对照组来自同期本院体检中心经彩超确认无胆囊结石的健康人群26例。其中男10例，女16例；年龄32～76岁，平均(48.35±11.33)岁。胆囊结石组与对照组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会审批同意，所有受试者知晓并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 仪器：Waters ACQUITY UPLC Ⅰ-Class/Xevo TQD超高效液相色谱系统(美国Waters公司)；H1650R台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；G560E涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；CV100-DNA-H真空离心浓缩仪(北京乾明基因技术有限公司)；UPLCBEH C18色谱柱(美国Waters公司，100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)。试剂：超高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)级甲醇、甲酸、乙腈购自美国Fisher Scientific公司；释放剂及内标液购自杭州佰辰公司；所有实验用水均为屈臣氏蒸馏水。

1.3方法

1.3.1样本的采集及预处理 (1)样本采集：胆囊结石组(术前)及对照组人员于清晨空腹采集静脉血5 mL并3 000 r/min 离心10 min，提取上清液保存于-80 ℃冰箱待测。(2)预处理：取100 μL血清样本，加入300 μL胆汁酸内标工作液，旋涡混合 5 min，12 000 r/min、4 ℃低温离心5 min，吸取上清液300 μL，低温浓缩2 h至近干；用100 μL的样本释放剂B液复溶，旋涡混合5 min，12 000 r/min、4 ℃低温离心5 min，取上清液80 μL于96孔板中，采用UPLC-MS/MS对胆汁酸进行分析。

1.3.2UPLC-MS/MS 分析 (1)采用线性梯度洗脱模式对胆汁酸进行色谱分离，流速为0.4 mL/min，柱温为45 ℃。流动相A为10% (体积比)的甲酸水溶液，动相B为乙腈∶甲醇(3∶1)的混合溶剂。梯度分离条件为：起始38%的流动相B维持0.5 min，至1.9 min升到48% B，第6.7 min 升到64% B，8.7 min 升到83% B，10.7 min 升到95% B，11.3 min降至起始梯度并平衡至12 min。进样量为5 μL。(2)质谱仪采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式进行离子化。采用多反应监测(MRM) 模式对胆汁酸谱进行定量检测。

2 结 果

15种胆汁酸亚组分[胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(GUDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)]中，胆囊结石组的GCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TUDCA、TCDCA水平高于对照组(P<0.05)；两组其余胆汁酸亚组分差异无统计学意义(P>0.05)。总胆汁酸正常组与对照组比较，总胆汁酸正常组DCA、UDCA比对照组低(P<0.05)，GUDCA、TCA比对照组高(P<0.05)，其余胆汁酸亚组分差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组胆汁酸谱的比较[M(P25,P75)，nmol/L]

3 讨 论

胆囊结石是临床上的一种多见病、常发病。多数患者并无明显症状，常于健康体检或其他疾病检查时发现。但是结石的存在会对胆囊的正常结构和功能产生影响，如占位性影响胆囊排空功能、结石嵌顿引起胆绞痛、结石反复摩擦胆囊壁诱发胆囊炎等[1]。目前胆囊结石的诊断和治疗已相对成熟，但术后发生其他疾病的风险也增大。有研究表明，胆囊结石、胆囊切除术可以增加大肠癌发生的危险性[8-9]。此外，胆囊结石术后结石复发率较高，约为20%[10-11]。因此，对胆囊结石形成的原因及预防的研究显得尤为重要。

胆汁酸是胆固醇的代谢产物，占人体总胆汁的50%～70%。胆汁酸成分的改变是胆囊结石形成的主要原因之一。在非疾病状态下，血清中胆汁酸各亚组分水平及比例基本稳定，其中CA约占总胆汁酸的40%，CDCA占40%，DCA占 18%，LCA 不足2%。在疾病状态下，受肝细胞功能和胆汁酸肝肠循环的影响，血清中胆汁酸各亚型的种类及含量可能发生改变，以致胆固醇不能维持微胶粒状态而析出，最终导致结石的形成。

本研究结果发现，胆囊结石组GCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TUDCA及TCDCA 6种胆汁酸亚组分水平比对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)。原因可能是由于胆囊结石患者体内结石大小、数量或部位不同导致部分患者胆汁淤滞，而使血清中的总胆汁酸升高。为排除胆囊结石组部分病例由于总胆汁酸升高而导致统计结果的偏差，作者对胆囊结石组中总胆汁酸处于正常参考范围内的病例与对照组进行比较，结果发现总胆汁酸正常组DCA、UDCA水平比对照组低，而GUDCA、TCA比对照组高(P<0.05)。由此推断，可能由于某种机制的作用，胆囊结石患者体内转化为DCA、UDCA的胆汁酸减少，而增加了GUDCA、TCA的转化生成，最终导致体内胆汁酸亚组分比例发生变化。

本研究与陈则旭[12]的相关报道存在异同。其相同之处在于，均发现胆囊结石组的GUDCA、TCA比对照组升高，UDCA比对照组下降；不同之处在于，陈则旭等[12]研究认为，胆囊结石组GCA和TCDCA比对照组升高。这可能因为本研究中未排除总胆汁酸升高因素。本研究结果提示，不论总胆汁酸升高与否，胆囊结石患者体内GUDCA和TCA水平比健康人高。另有研究认为，胆汁酸各亚组分在胆石症发生前，即超声、CT等结果正常时已有明显的改变[11]。

综上所述，GUDCA和TCA可能为胆囊结石诊断和预防的重要标志物，但限于本研究的样本量较少，后续还需要进行大样本的研究。