骨科创伤患者伤口分泌物金黄色葡萄球菌毒力基因分析

陈日寿，段俊林，陈 伟，叶林强，冯永洪，黄祖辉，刘亮洪

(1.东莞市中医院检验科，广东 东莞 523000；2.东莞市中医院骨科，广东 东莞 523000)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SAU)广泛分布于自然界中，是人类化脓性感染中常见的病原菌，也是创伤患者感染常见的病原菌之一[1]。SAU可携带多种毒力基因，不同种的毒力基因具备特定的生物学特性和致病特征，使菌株在毒力强度上具有明显不同[2]。SAU相关毒力基因研究多见于鼻窦[3]及乳腺[4]感染等，而针对骨科创伤患者分离株毒力基因的研究尚少。为了解骨科创伤患者伤口分泌物SAU毒力基因检出情况，本研究收集了80株骨科创伤患者伤口SAU分离株，检测其毒力基因种类分布，并分析感染不同深浅位置的毒力基因分布情况，探讨毒力基因与感染深浅位置的关系，旨为防控SAU的医院内感染提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018年10月至2019年12月东莞市中医院骨科创伤患者伤口分泌物标本80份，经细菌培养分离出80株SAU菌株，根据感染深浅位置将其分为浅表感染组和深部感染组，每组40株。浅表感染为仅累计皮肤及皮下组织的感染，并具备下述情况之一：(1)伤口浅层有分泌物；(2)伤口浅层分泌物培养出细菌；(3)疼痛或压痛、肿胀、红热，医生因此将切口开放。深部感染为累及伤口深部筋膜及肌层的感染，并至少具备下述情况之一：(1)从伤口深部流出脓液；(2)伤口深部自行裂开或有医生打开，且体温>38 ℃、局部疼痛或压痛；(3)经临床、手术、病理组织学或影像学诊断发现切口深部有脓肿[5]。浅表感染组男26例，女14例；年龄32～74(52.4±6.5)岁。深部感染组男29例，女11例；年龄30～77(50.4±7.6)岁。2组患者的性别与年龄的比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准：所有患者及家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理骨科创伤患者使用抗生素前,采用无菌技术从其创伤处采集分泌物,置于一次性无菌试管内送检，及时接种于血平板、麦康凯平板和沙保氏平板，置于35 ℃温箱中过夜培养，挑取血平板上菌落，同一患者多次送检同类标本分离出同种细菌的只采用第1株。质控菌株：SAU ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、粪肠球菌ATCC29212均来源于国家卫生计生委临床检验中心。

1.2.2 试剂与仪器血平板、麦康凯平板和沙保氏平板均购自江门凯林贸易有限公司；细菌鉴定采用法国梅里埃公司的Vitek2 Compact全自动细菌检测分析系统及其配套的GP鉴定卡。

1.3 毒力基因检测采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)进行毒力基因检测，靶基因引物序列由广州蓝吉生物技术有限公司合成，靶基因引物序列：bbp上游引物序列为5′-CAACTACTACTGATGCCTCGGGTAA-3′，下游引物序列为5′-TTTAACCGTTGGCGTGTAACC-3′，目的产物长度104 bp；clfA上游引物序列为5′-TTTAGCGGCAGTAGCTGCAG-3′，下游引物序列为5′-TGCGGATACACAGTCGTACCAG-3′，目的产物长度105 bp；clfB上游引物序列为5′-AACGATTTCCAATGCGCAAG-3′，下游引物序列为5′-AGCAGCATTTACTACCGGTTCA-3′，目的产物长度93 bp；cna上游引物序列为5′-ATTAAAGTGGCATGGCCGAC-3′，下游引物序列为5′-CTGCTTGACCCACCTGTTCA-3′，目的产物长度96 bp；ebpS上游引物序列为5′-AAGACGCCGTGATTTAGCAAC-3′，下游引物序列为5′-CGATCATCTATTGTGCCAGCC-3′，目的产物长度102 bp；fnbA上游引物序列为5′-CAAACCCAGGTGGTGGTCAG-3′，下游引物序列为5′-TGTATGATCGCTCACTGCGC-3′，目的产物长度101 bp；hla上游引物序列为5′-AGGAAAAATTGGCGGCCTTA-3′，下游引物序列为5′-AGTTGGGCTCTCTAAAATTGTTTTG-3′，目的产物长度 97 bp；hlb上游引物序列为5′-TGGTGGCGTAGCGATTGTAA-3′，下游引物序列为5′-TCCAGCACCACAACGTGAAT-3′，目的产物长度187 bp；hld上游引物序列为5′-AATTTGTTCACTGTGTCGATAATCCA-3′，下游引物序列为5′-AATTAAGGAAGGAGTGATTTCAATGG-3′，目的产物长度 90 bp；hlg上游引物序列为5′-TTCGCCACTGAATCAGGTCA-3′，下游引物序列为5′-TGTCGCTTGAACCTTTTTCGT-3′，目的产物长度181 bp；icaA上游引物序列为5′-AGACACTTGCTGGCGCAGT-3′，下游引物序列为5′-CCTCCCAATGTTTCTGGAAC-3′，目的产物长度202 bp；lukE上游引物序列为5′-CCAAATGGTCCGTCAGGTTC-3′，下游引物序列为5′-CCAGTTCTAGGGAATAAAGTCGCA-3′，目的产物长度197 bp；lukM上游引物序列为5′-TCCGTCTTTTATCGCGACAGT -3′，下游引物序列为5′-TTCGGACGTTTTCCAATTCAC-3′，目的产物长度199 bp；map上游引物序列为5′-TTGATGTGCCATTTACTGCAATT-3′，下游引物序列为5′-AGTTCATGCGAAAGATGTTAAGAGAAT-3′，目的产物长度107 bp；pvl上游引物序列为5′-TGTGCCAGACAATGAATTACCC-3′，下游引物序列为5′-TCACTTTAGGCTGATCTGCAGTTG-3′，目的产物长度136 bp；sdrC上游引物序列为5′-AAATGAAACGACAGCCCCAAG-3′，下游引物序列为5′-TCACTTTAGGCTGATCTGCAGTTG-3′，目的产物长度104 bp；sdrD上游引物序列为5′-GGTAGATGCCAAAACTGAATCAACT-3′，下游引物序列为5′-TGATGATGGCTGTACTGCTGC-3′，目的产物长度190 bp；sdrE上游引物序列为5′-AGAAAAGCCAATGGCAAACGT-3′，下游引物序列为5′-CAGCTGGCGTTTCGAATTTAAC-3′，目的产物长度146 bp；splB上游引物序列为5′-GAATTTCTTGATCTCGGGTGTGA-3′，下游引物序列为5′-TCACCTCTGGGTCTTTAGCAACA-3′，目的产物长度122 bp；SSP上游引物序列为5′-AAGATTGCAGATCCATCGGC-3′，下游引物序列为5′-TCACCTCTGGGTCTTTAGCAACA-3′，目的产物长度181 bp。PCR扩增参数为：95 ℃预变性 3 min，然后95 ℃变性15 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸35 s，共40个循环，最后1个循环72 ℃延长至7 min。同时设置蒸馏水为阴性对照，加入SAU 16 sDNA作为内参。取5 μL PCR产物与1 μL缓冲液混均，点入琼脂糖凝胶，120 V电泳40 min，凝胶成像系统成像并记录。

1.4 毒力基因分析观察浅表感染组和深部感染组SAU菌株的毒力基因分布情况，比较2组SAU菌株毒力基因检出率的差异。

1.5 统计学处理应用SPSS 19.0软件进行数据统计与分析；计数资料以株数和百分率表示，2组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAU毒力基因检出情况80株SAU共检出20种毒力基因，分别为黏附素基因bbp、clfA、clfB、cna、ebpS、fnbA、sdrC、sdrD、sdrE、icaA、map,溶血毒素基因hla、hlb、hld、hlg,杀白细胞素基因lukE、lukM、pvl,侵袭毒素基因splB、ssp。其中各种毒力基因的检出情况分别为：黏附素基因bbp 78株(97.5%)、clfA 74株(92.5%)、clfB 75株(93.8%)、cna 66株(82.5%)、ebpS 75株(93.8%)、fnbA 80株(100.0%)、sdrC 56株(70.0%)、sdrD 40株(50.0%)、sdrE 77株(96.2%)、icaA 78株(97.5%)、map 72株(90.0%),溶血毒素基因hla 80株(100.0%)、hlb 78株(97.5%)、hld 74株(92.5%)、hlg 72株(90.0%),杀白细胞素基因lukE 71株(88.8%)、lukM 6株(7.5%)、pvl 19株(23.8%),侵袭毒素基因splB 14株(17.5%)、ssp 66株(82.5%)。

2.2 浅表感染组与深部感染组SAU毒力基因检出率比较结果见表1。浅表感染组及深部感染组fnbA、hla基因检出率均为100.0%(40/40)；深部感染组SAU的clfA、pvl、ssp基因检出率高于浅表感染组，差异有统计学意义(P<0.05)；深部感染组SAU的bbp、clfB、cna、ebpS、sdrC、sdrD、sdrE、icaA、map、hlb、hld、hlg、lukE、lukM及splB基因检出率与浅表感染组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组SAU毒力基因分布及检出率比较

3 讨论

健康人SAU在鼻腔黏膜定植率为7.7%～25.4%[6-7],人体皮肤也是SAU的高定植部位。骨科创伤患者因骨折或手术等原因导致体表屏障受损和创伤部位组织液渗出，增加了原本定植的SAU的感染机会[8]，一旦SAU成功定植在创伤部位，就可以分泌毒素以逃避宿主免疫系统并分解宿主细胞，有助于SAU在创伤部位的侵袭和传播[9]。

本研究从收集的80例骨科创伤患者的伤口分泌物标本中共分离出80株SAU菌株，采用PCR法对80株SAU进行毒力基因检测，共检出黏附素基因、溶血毒素基因、杀白细胞素基因及侵袭毒素基因4类共20种毒力基因。

黏附素基因编码的黏附素是存在于细胞表面的具有使细菌黏附到宿主靶细胞作用的特殊结构和相关蛋白，是识别黏附基质分子的微生物表面组分之一，与SAU附着于人细胞外基质上从而完成定植与感染有关。研究表明，clfA基因编码的膜结合蛋白凝集因子与纤维蛋白原结合的能力对SAU的致病能力十分重要[10]，其结合产物可将机体免疫细胞限制在感染灶周围,使其无法接触到感染灶中心的细菌。本研究中,黏附素基因clfA、clfB基因检出率在87.5%以上，低于PARK等[11]报道的100.0%检出率，而fnbA检出率高于其报道，其差异究竟是由于菌株来源不同还是纳入研究的标本数不同所导致，尚需进一步研究。

杀白细胞素是由SAU菌株表达的细胞外毒素，是主要的致病因子之一，通过诱导多核白细胞的坏死或凋亡，最终导致白细胞死亡和组织坏死。研究发现，携带杀白细胞素基因的SAU感染者体温更高，感染范围广，胸腔积液多，炎症指标水平高，侵袭性感染比例高，且并发症严重，住院时间长[12]。本研究中80株SAU菌株共有19株检出pvl基因，检出率为23.7%，高于丛萌倩[13]的报道；而lukE和lukM基因检出率分别为88.8%和7.5%，高于蒋斓等[4]的相关报道；分析其原因，除不同地区杀白细胞素基因阳性SAU菌株的流行存在差异外，也与本研究菌株来源于骨科创伤患者，而其他研究对象多为鼻窦或乳腺组织感染者有关。

携带侵袭毒素基因的SAU可使炎症向组织纵深发展，使感染进一步扩散。本研究中，80株SAU的侵袭毒素基因ssp和splB的检出率分别为 82.5%和17.5%，与许小敏[14]等报道的烧伤患者ssp和splB的检出率为0.0%和60.0%有很大差别，这种差异究竟是地区流行差异还是其他原因所致尚需进一步探讨。

溶血毒素是SAU菌株产生的造孔蛋白之一，根据抗原不同可将溶血毒素分为α、β、γ和δ 4种，分别由hla、hlb、hld、hlg 4种基因编码。溶血毒素是SAU感染的关键毒力因子，通过损伤红细胞、血小板引起局部缺血坏死。本研究中，hla、hlb、hld、hlg 4种溶血毒素基因的检出率分别为100.0%、97.5%、92.5%、90.0%，其中hla基因的检出率与蒋斓等[4]报道一致，而hlb、hld、hlg 3种溶血毒素基因的检出率高于蒋斓等[4]的报道，可能与菌株来源及标本数量不同有关。

SAU相关毒力基因研究多见于鼻窦[3]及乳腺[4]感染等，本研究以临床感染深浅位置将从骨科创伤患者伤口分泌物分离的80株SAU菌株分为浅表感染组和深部感染组，结果显示，浅表感染组及深部感染组 SAU的fnbA、hla基因检出率均为100.0%(40/40)，深部感染组SAU的黏附素基因clfA、杀白细胞素基因pvl、侵袭毒素基因ssp检出率显著高于浅表感染组，深部感染组SAU的bbp、clfB、cna、ebpS、sdrC、sdrD、sdrE、icaA、map、hlb、hld、hlg、lukE、lukM及splB基因检出率与浅表感染组比较差异无统计学意义；提示黏附素基因clfA、杀白细胞素基因pvl、侵袭毒素基因ssp可能在影响SAU的黏附定植并导致定植部位的组织坏死，进而使炎症向组织纵深扩散，最终导致深部感染的进程中起关键作用。

综上所述,骨科创伤患者伤口分泌物分离SAU检出的20种毒力基因在浅部感染和深部感染患者均有检出，其中clfA基因、pvl基因和ssp基因可能与感染深度有关。