人参皂苷Rb1对MPTP诱导的神经元损伤和小鼠行为学异常的作用研究

耿艺娟，孙梦桢，赵进东，宋京风，胡炜彦*

1昆明医科大学 药学院暨云南省天然药物药理重点实验室；2昆明医科大学 生物医学工程中心，昆明 650500

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是继阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)之后，影响中枢神经系统(central nervous system，CNS)的第二大常见神经退行性疾病。其主要病理学特征是多巴胺能神经元进行性死亡[1]，同时会出现酪氨酸羟化酶(TH)减少[2]；其主要临床症状包括运动障碍(包括僵直，运动功能减退，静止性震颤等)和非运动障碍(睡眠不足，记忆减退等)[3]。黑质多巴胺能神经元从背侧纹状体内的轴突末端以及中脑内的细胞体和树突以钙活性依赖的方式释放多巴胺，它们在体内的产生和代谢是由不同离子通道的协调功能来调节的[4]，如铁、锌、铜、钙都参与到了其中[5]。在全球大概每1 000万60岁老年人中，就有1%的人患有此病，并且随着全国人民生活水平的上升以及全球人口老龄化，帕金森症的患病人数也在逐渐增加[6]。迄今为止，还没有发现可以完全治疗帕金森症的方法，目前上市的治疗药物也仅仅只能改善帕金森病的症状却不能完全治愈，这就使得帕金森病的治疗研究成为一个亟待解决的问题[7]。

人参皂苷Rb1是人参、三七的主要活性成分[8]，人参具有安神、益智的作用[9]，三七对脑损伤具有保护作用，并且可以改善记忆[10]。人参皂苷Rb1可以改善大脑神经细胞缺氧凋亡、修复中枢神经系统损伤，具有很好的应用开发前景[11]。有研究表明，人参皂苷Rb1通过上调MPTP小鼠模型中的谷氨酸转运蛋白GLT-1来改善运动功能障碍，预防DA神经元死亡[12]。而本文主要探讨人参皂苷Rb1是否可以通过FP1、CaMKII以及抗凋亡蛋白Bcl-2来改善MPTP诱导的PD模型所造成的损伤，以期为帕金森的预防和治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57B/L6雄性小鼠、C57B/L6孕18天的雌性小鼠(SPF)，购自昆明医科大学实验动物学部。合格证号：(SCXK(滇)-K2020-0006)。

1.2 药物与试剂

人参皂苷Rb1(云南植物药业有限公司，批号20171201，纯度：98.5%)；MPTP(Sigma公司，货号M0896)；神经元培养液(neurobasal medium，货号12340817)、DMEM培养基(货号11039021)、胰蛋白酶(Trypsin，货号25200072)、磷酸盐缓冲液(PBS，货号10010023)、青霉素-链霉素(P/S，货号15070063)、胎牛血清(fatal bovine serum，FBS，Invitrogen公司)；Anti-Bcl-2(Abcam公司，货号ab194583)；Anti-CaMKII(Abcam公司，货号ab52476)；Anti-FP1(Invitrogen公司，货号PA5-22993)；Anti-TH(Abcam公司，货号ab137869)；Anti-β-actin(Thermo Fisher Scientific公司，货号MA1-91399)。

1.3 原代小鼠多巴胺能神经元的培养

怀孕约18天的C57BL/6孕鼠经过脱臼处死后取出胎鼠，断头处理并在无菌操作下分离出胎鼠的中脑膜侧组织，剪碎，用0.125%的Trypsin在37 ℃水浴中消化15 min，用含10% FBS的DMEM终止消化，75 μm筛网滤过，滤液离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清。加神经元培养液混悬，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清。加神经元培养液混悬，测细胞浓度，调整细胞浓度为5.5 × 105个/mL，接种于用0.01% PDL包被后的6孔板中。然后培养至第7天，给药并通过显微镜观察[13]。

1.4 实验分组与给药

分离出的神经元分为对照组(试剂空白组，C)、模型组(MPTP，10 μmol/L)，给药组人参皂苷Rb1低剂量组(L，10 μmol/L)、人参皂苷Rb1中剂量组(M，20 μmol/L)、人参皂苷Rb1高剂量组(H，40 μmol/L)预处理30分钟后给予MPTP(10 μmol/L)24小时。C57BL/6雄性小鼠分为对照组(试剂空白组，C)、模型组(MPTP，30 mg/kg)、人参皂苷Rb1低剂量组(L，10 mg/kg)、人参皂苷Rb1中剂量组(M，20 mg/kg)、人参皂苷Rb1高剂量组(H，40 mg/kg)。MPTP通过生理盐水溶解后对C57BL/6雄性小鼠腹腔注射持续7天，MPTP通过DMSO溶解然后对神经元进行药物治疗；人参皂苷Rb1通过CMC-Na混悬然后对C57BL/6雄性小鼠灌胃给药持续14天，人参皂苷Rb1通过DMSO溶解然后对神经元进行损伤。

1.5 旷场实验

实验用的旷场是方形的观察区，长×宽×高：50 cm × 50 cm × 40 cm，主要用来研究动物在旷场的自主活动从而评价其运动能力。实验在安静的环境下进行，将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察5 min后停止摄像，75%酒精喷洒方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便，气味)影响下次测试结果。酒精挥发后更换动物，继续实验。根据计算机软件统计小鼠在5 min内的运动距离。通过Prism进行数据统计。

1.6 爬杆实验

小鼠的爬杆装置包括底座、垂直长杆约80 cm且直径1 cm，以及圆球。用来评价小鼠的运动抓握能力。实验在安静的环境下进行。将小鼠从圆球处放在长杆上让其从杆子顶端走至杆子底端，同时进行摄像和计时。小鼠走到杆子端底时停止计时。75%酒精喷洒长杆，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便，气味)影响下次测试结果。酒精挥发后更换动物，继续实验。根据计算机软件统计小鼠从杆子顶端走至杆子底端的时间。通过Prism进行数据统计。

1.7 蛋白表达量检测

将C57BL/6小鼠经过断头处理，分离出纹状体，加入RIPA Buffer 100 μL，冰上裂解30 min后，13 200 r/min离心，取上清液，然后通过BCA蛋白测定试剂盒对蛋白进行定量，方法参照试剂盒说明书。定量结束后，将所有蛋白稀释至同一浓度，然后将稀释好的蛋白加入1× LDS Sample Buffer，95 ℃变性5 min，保持蛋白的稳定性。蛋白样品通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上。在室温下用5%的牛奶封闭2 h，然后将膜与一抗(TH、CaMKII、FP1、Bcl-2)在4 ℃摇床下孵育过夜。将孵育后的膜在TBST中洗涤3次后，室温下与荧光二抗孵育1 h。随后，将膜用TBST再洗涤三遍，通过双色红外激光成像系统成像，使用Quantity-One定量蛋白质水平，通过Prism进行数据统计。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 人参皂苷Rb1对MPTP诱导的多巴胺能神经元的影响

与对照组相比，MPTP模型组的神经元明显减少，轴突断裂，碎片多。与MPTP模型组相比，人参皂苷Rb1低、中、高剂量组都在一定程度上改善了MPTP诱导的神经元的损伤(见图1)。

图1 人参皂苷Rb1对MPTP诱导的小鼠多巴胺能神经元的影响

2.2 人参皂苷Rb1对MPTP诱导的PD小鼠运动能力的影响

旷场实验是人们普遍认可的用于测量动物运动行为的经典实验。我们首先用旷场实验检测了不同组别小鼠的运动行为。实验结果显示，与对照组相比，MPTP的小鼠模型组在旷场中的运动轨迹较少(见图2A)；在旷场实验中小鼠的运动距离显著降低(见图2B)。与MPTP模型组相比，人参皂苷Rb1低、中、高剂量组都在一定程度上改善了MPTP诱导的PD小鼠在旷场中的运动能力(见图2A、2B)。

图2 人参皂苷Rb1对MPTP诱导的PD小鼠运动能力的影响

2.3 人参皂苷Rb1对MPTP诱导PD小鼠抓握能力的影响

爬杆实验可以检测小鼠的抓握能力及运动能力。实验结果显示，与对照组相比，MPTP模型组的小鼠在爬杆实验中从杆子顶端到杆子底端的时间明显增加。与MPTP模型组相比，在给予人参皂苷Rb1时，人参皂苷Rb1低、高剂量组都明显降低了小鼠从杆子顶端到杆子底端的运动时间(见图3)。

图3 人参皂苷Rb1对MPTP诱导PD小鼠抓握能力的影响

2.4 人参皂苷Rb1对MPTP诱导PD小鼠相关蛋白的影响

MPTP会使钙蛋白酶I和II激活，从而干扰正常细胞功能，导致细胞神经损伤。MPTP诱导的PD模型小鼠中铁水平会增加，铁转运蛋白1(ferroportin-1，FP1)是一种新发现的铁输出蛋白，它的表达降低与铁水平的增加息息相关。除此之外，MPTP处理的小鼠Bcl-2表达量会降低，Bcl-2在细胞凋亡和自噬是中起着关键性作用，它的失衡与帕金森病等神经退行性疾病有关。我们的研究结果表明，与对照组相比，MPTP模型组TH表达量表现出显著性降低(见图4A、4B)；CaMKII的表达量没有显著性差异(见图4A、4C)；FP1的表达量表现出显著性降低(见图4A、4D)；Bcl-2的表达量显著性降低(见图4A、4E)。与MPTP模型组相比，人参皂苷Rb1中、高剂量组在TH的表达量中表现出显著性升高(见图4A、4B)；人参皂苷Rb1给药组在CaMKII、FP1的表达量中没有显著性差异(见图4A、4C、4D)；人参皂苷Rb1中剂量组在Bcl-2的表达量中表现出显著性升高(见图4A、4E)。

图4 人参皂苷Rb1对MPTP诱导PD小鼠相关蛋白的影响

3 讨论与结论

PD是世界上第二大神经退行性疾病，危害着人们的健康。PD中的神经化学异常是黑质中多巴胺能神经元的退化，导致纹状体多巴胺(DA)水平降低，原代培养物是研究多巴胺能神经元特性和特征的最相关模型之一。可以将这些培养物置于模拟PD病理学的各种应激剂和神经保护化合物中，以阻止或减缓神经元退化[14]。因此我们通过体外培养多巴胺能神经元并通过MPTP损伤，观察神经元的形态。此外PD所造成的运动损伤，以及TH酪氨酸阳性激酶的减少是其主要特征[15]。MPTP是一种神经毒素，并且是迄今为止研究帕金森病的“最佳”模型[16]。因此在本研究中通过我们旷场实验与爬杆实验检测MPTP诱导的PD模型所产生的运动障碍，发现MPTP模型组表现出明显的运动功能损伤，此外对MPTP诱导的小鼠模型的纹状体蛋白进行检测结果显示MPTP模型组TH表达量表现出显著性降低。

离子稳态在帕金森病中起着关键性作用。其中钙、铁稳态提及较多，且钙、铁稳态之间也相互影响，失调的铁或钙水平会促进铁和钙之间的有害串扰，从而导致神经元功能障碍和死亡[17]。Ca2+可能是协调复杂细胞器网络来最终实现代谢相互作用、细胞内信号传导、细胞维持和细胞存活调节的关键参与者，是细胞适应环境的基本元素，其稳态的破坏在MPP+毒性中起着至关重要的作用。MPTP会导致细胞内Ca2+升高，导致Ca2+依赖性酶的激活，例如蛋白激酶和钙蛋白酶I和II，从而干扰正常细胞功能，导致细胞损伤[18]。在本研究中对MPTP损伤后CaMKII的表达量进行检测，发现CaMKII的表达量没有显著性差异。铁沉积是帕金森病(PD)病因学的关键因素之一。铁稳态是通过铁转运蛋白和铁储存蛋白之间的相互作用来维持的。铁运输受损或铁储存改变可能会破坏铁稳态平衡。有研究表明MPTP诱导的PD模型小鼠中铁水平会增加。铁转运蛋白1(ferroportin-1，FP1)是一种新发现的铁输出蛋白，它在黑质中的表达降低可以解释铁水平的增加[19]。在本研究中对MPTP损伤后FP1的表达量进行检测，发现FP1的表达量表现出显著性降低。除此之外，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，有研究表明MPTP处理的小鼠Bcl-2表达量会降低，细胞凋亡和自噬是维持机体稳态和促进生存的重要细胞内过程[20]，它们的失衡与神经退行性疾病有关，例如PD，B细胞淋巴瘤Bcl-2家族成员参与维持自噬和凋亡之间的平衡，恢复自噬和细胞凋亡之间的平衡是治疗PD的一种有前景的策略[21]。因此最后在本研究中我们还检测了MPTP损伤后Bcl-2表达量，发现Bcl-2的表达量显著性降低。

人参皂苷Rb1已被证实对几种中枢神经系统疾病具有神经保护作用[22]。有研究通过免疫组化、免疫印迹、PCR、电生理等实验发现Rb1改善了PD动物模型中的运动障碍，并且可以上调谷氨酸转运蛋白GLT-1的来终止黑质纹状体和皮质酮系统中的谷氨酸兴奋性毒性。在一篇报道中，通过MPTP诱导PD模型小鼠，水迷宫、旷场实验、电生理、免疫印迹、免疫荧光等方面检测了人参皂苷Rb1通过调节α-突触核蛋白/PSD-95途径阻止MPTP诱导的海马记忆变化[12]。而我们的研究主要针对MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤及PD小鼠模型来探讨人参皂苷Rb1对行为异常的改善作用及与抗凋亡蛋白Bcl-2之间的联系。

我们的结果显示人参皂苷Rb1可以恢复MPTP所造成的运动损伤，可以显著改善MPTP所造成的TH酪氨酸阳性激酶的减少，这为帕金森的进一步治疗以及中药材活性成分的开发和使用提供了相关的方法。我们的研究还表明人参皂苷Rb1在抗凋亡蛋白Bcl-2方面表现出显著性差异；人参皂苷Rb1虽然没有对FP1以及CaMKII的表达量表现出显著性差异，但MPTP确实造成了FP1表达量的减少，这可以为相关的研究提供一些想法，除此之外，人参皂苷Rb1在除了抗凋亡蛋白之外的其他机制还有待研究。